Scanning Electron Microscope (SEM)
개요
Scanning electron microscope (SEM)는 specimen 표면의 three-dimensional structure의 이미지를 직접 생성한다. SEM은 일반적으로 transmission electron microscope보다 더 작고, 단순하며, 저렴하다.
SEM의 기본 원리
TEM과의 차이
TEM: Specimen을 통과한 electrons를 사용하여 이미지 형성 SEM: Specimen 표면에서 scattered 또는 emitted된 electrons를 사용
작동 방식
Specimen을 heavy metal layer로 coating하거나 rapidly frozen한 후, cooled specimen stage에 coating하여 microscope에서 검사한다.
Scanning 과정
Electron Beam Scanning
매우 좁은 electron beam으로 specimen을 scan함 Primary beam: 표면의 각 연속적인 point를 bombardment
Signal Collection
측정: Primary beam이 metallic surface의 각 연속 point를 bombard할 때 scattered 또는 emitted되는 electrons의 양 Image building: Computer screen에 이미지 구축
Figure 9-45: Scanning Electron Microscope
SEM 작동 원리:
- Specimen이 electromagnetic coils(lenses 역할)에 의해 specimen에 초점을 맞춰진 electron beam으로 scan됨
- Detector는 beam이 표면의 각 연속 point를 bombard할 때 scattered 또는 emitted되는 electrons의 양을 측정
- 연속적인 points의 강도를 screen에 구축된 이미지에 기록
결과: SEM은 0.5 nm에서 10 nm 사이의 resolution으로 three-dimensional objects의 striking images 생성 (instrument 종류에 따라)
Photograph: 실제 사용 중인 SEM (courtesy of Andy Davis)
SEM의 특징
1. Depth of Field
큰 depth of field: Objects가 near와 far 모두 field of view에서 선명하게 이미지화됨 3D appearance: Surface angle이 beam에 대해 상대적이므로 electron scattering 양이 달라져 highlights와 shadows 생성
2. Surface Imaging
표면만 관찰: 내부 구조는 볼 수 없음 해상도: 약 10 nm (standard SEM) 결과: 주로 whole cells과 tissues 연구에 사용됨 (subcellular organelles보다)
Figure 9-46: SEM의 다양한 Magnifications
(A) Developing Wheat Flower (Spike)
표본: 발달 중인 wheat flower spike 준비: Rapidly frozen, thin metal film으로 coated, frozen state에서 SEM으로 검사
특징:
- 이 low-magnification micrograph는 large specimen에서도 SEM의 큰 depth of focus 보여줌
- 섬세한 flower spike의 전체 구조 가시화
(B) Pollen Grains from Hellebore Flower
표본: Hellebore flower의 pollen grains 특징: Sculpted cell walls를 SEM에서 드러냄
의의:
- Shapes와 patterns는 각 pollen grain species에 특이적
- 종 식별에 사용 가능
(C) Bacteria Chains in Stilton Cheese
표본: Stilton cheese의 blue veins에 사는 bacteria chains 관찰: 개별 bacterial cells와 chain formation
모든 이미지 제공: Kim Findlay
Resolution 범위
Standard SEM
Resolution: 약 10 nm 용도: Cells, tissues, large structures 장점: 넓은 field of view, 큰 depth of field
High-resolution SEM
Resolution: 약 0.5 nm Field-emission gun 사용: 밝고 coherent electron source
High-resolution SEM
Field-emission Gun
특징:
- Very bright electron source
- Coherent beam
- 향상된 resolution
Resolution 원리
SEM의 resolution: Electron beam의 wavelength가 아닌 specimen을 scan하는 electron spot의 크기에 의존 결과: 이 type의 SEM은 TEM의 negatively stained specimen과 비슷한 resolution의 이미지 생성 가능
Figure 9-47: Higher-resolution SEM
표본: Macromolecular assemblies 준비: 매우 얇은 tungsten coating으로 shadowed Imaging: Field-emission electron gun을 갖춘 SEM
(A) Actin Filament
구조: Actin monomers의 helical arrangement 보여줌 Resolution: 개별 subunits 식별 가능
(B) Clathrin-coated Vesicles
구조: Vesicle 표면의 clathrin coat pattern Detail: Coat의 basket-like structure
의의: 이러한 high-resolution images는 macromolecular architecture 연구에 유용
SEM의 장점
1. 3D Visualization
Direct 3D images: Surface topology의 직접적 가시화 Depth of field: 큰 depth로 전체 구조 선명 Natural appearance: Highlights와 shadows로 3D 느낌
2. 큰 Specimens
Whole organisms: Entire small animals나 plant parts (Figure 9-46A) Minimal preparation: TEM보다 덜 복잡한 준비 Large field of view: 넓은 영역 한 번에 관찰
3. Surface Details
Texture: 표면 texture와 topography Patterns: Surface patterns (pollen grains, Figure 9-46B) Morphology: Cell과 tissue morphology
4. 상대적 단순성
Operation: TEM보다 사용하기 쉬움 Cost: 일반적으로 더 저렴 Maintenance: 덜 복잡한 유지보수
SEM의 한계
1. 표면만 관찰
No internal structure: 내부 ultrastructure 볼 수 없음 해결책: 필요시 specimen을 fracture하거나 section
2. 제한된 Resolution (Standard)
약 10 nm: TEM보다 낮음 Sub-cellular details: Organelles의 fine details 어려움 개선: High-resolution SEM으로 0.5 nm까지 가능하지만 비용 증가
3. Coating 필요
Metal coating: Conductive layer 필요 Artifacts 가능성: Coating 과정에서 일부 detail 손실 두께: Coating이 매우 얇아야 함
4. Vacuum 환경
고정 표본: 살아있는 세포 관찰 불가 Environmental SEM: 일부 models에서 hydrated specimens 가능하지만 제한적
Special SEM Techniques
Environmental SEM (ESEM)
특징: Hydrated specimens 관찰 가능 낮은 vacuum: 완전한 vacuum 불필요 응용: 생물학적 표본을 더 자연스러운 상태로
Cryo-SEM
냉동 표본: Frozen state에서 관찰 (Figure 9-46A) 구조 보존: 우수한 preservation Sublimation: Ice를 제거하여 내부 구조 노출 가능
Backscattered Electron Imaging
Contrast: 원자 번호에 따른 contrast Composition: Material composition 정보 응용: Geological과 materials science samples
응용 분야
발생 생물학
Embryos: Embryo surface morphology Organ development: Tissue organization Plant development: Flower, seed structures (Figure 9-46A)
미생물학
Bacterial morphology: Cell shapes, surface features Biofilms: 3D architecture (Figure 9-46C) Fungal structures: Hyphae, spores
식물학
Pollen: Species identification (Figure 9-46B) Leaf surfaces: Stomata, trichomes Root structures: Root hairs, nodules
Materials Science
Surface characterization: Material surfaces Fracture analysis: Fracture surfaces Quality control: Product inspection
기술적 고려사항
Specimen Preparation
Coating: 일반적으로 gold, platinum, or carbon Thickness: 수 nm의 thin layer Fixation: Chemical fixation 또는 rapid freezing
Imaging Parameters
Accelerating voltage: 일반적으로 5-30 kV Working distance: Specimen과 detector 사이 거리 Spot size: Resolution과 signal intensity의 trade-off
Detector Selection
Secondary electrons: Surface topology (가장 일반적) Backscattered electrons: Compositional information Multiple detectors: 동시에 다른 정보
SEM vs 다른 Microscopy 기술
vs TEM:
- SEM: Surface, 3D, ~10 nm (standard)
- TEM: Internal structure, 2D sections, ~0.05-1 nm
vs Light Microscopy:
- SEM: Higher resolution, 3D surface, 고정만
- Light: 살아있는 세포, 낮은 resolution
- SEM: Surface detail, electron microscopy
- Confocal: Internal 3D, fluorescence, 살아있는 세포
요약
핵심 원리: Electron beam으로 specimen 표면 scan, scattered/emitted electrons로 3D surface image 생성 Resolution: Standard ~10 nm, high-resolution ~0.5 nm 주요 장점: 직접적인 3D visualization, 큰 depth of field, large specimens, 상대적 단순성 주요 한계: 표면만 관찰, 제한된 resolution (standard), coating 필요, 고정 표본만 응용: Whole organisms, surface morphology, tissue architecture, pollen identification, bacterial structures 특수 기술: Environmental SEM, cryo-SEM, backscattered imaging
참고 문헌
Chapter 9: Visualizing Cells and Their Molecules, Section: “The Electron Microscope Resolves the Fine Structure of the Cell”, Related Figures: 9-45, 9-46, 9-47, Related concepts: Transmission Electron Microscope, Biological Specimen Preparation for Electron Microscopy