Deconvolution
복잡한 3차원 객체의 Optical Microscope Imaging
배경 및 문제점
기존 광학 현미경의 한계
일반 광학 현미경의 경우, 조직을 얇은 sections(절편)으로 잘라서 검사해야 한다:
- Section이 얇을수록 이미지가 더 선명함
- 그러나 sectioning 시 세 번째 차원에 대한 정보가 손실됨
근본적인 문제들
1. 3차원 구조 파악의 어려움
- 세포나 조직의 three-dimensional architecture(3차원 구조)를 어떻게 파악할 것인가?
- Sections으로 먼저 자를 수 없는 표본의 microscopic structure를 어떻게 볼 것인가?
2. Out-of-focus Blur 문제
Optical microscope가 three-dimensional specimen 내의 특정 focal plane(초점 평면)에 초점을 맞출 때:
- 초점 평면 위아래의 표본의 다른 모든 부분도 조명됨
- 이러한 영역에서 발생하는 빛이 out-of-focus blur로 이미지에 기여함
문제점:
- 이미지를 상세히 해석하기 매우 어려움
- 미세한 이미지 구조가 out-of-focus light에 의해 가려질 수 있음
해결 방법: 두 가지 보완적 접근법
복잡한 three-dimensional 구조를 다루기 위한 두 가지 서로 다르지만 보완적인 접근법:
- Computational approach(계산적 접근) → Image deconvolution
- Optical approach(광학적 접근) → Confocal microscopy
공통 목표
두 방법 모두 다음을 가능하게 한다:
- 두꺼운 표본에서 선택한 평면에 초점을 맞춤
- 그 평면 위아래의 out-of-focus 영역에서 나오는 빛을 제거
- 따라서 선명하고 얇은 optical section(광학 절편) 확보
Three-dimensional Image 재구성
- 서로 다른 깊이에서 촬영한 일련의 optical sections을 computer에 저장
- Three-dimensional image를 재구성 가능 (Movie 9.1 참조)
비유:
- 현미경 관찰자를 위해 CT scanner가 방사선 전문의를 위해 하는 것과 동일한 작업
- 두 기계 모두 온전한 구조의 내부에 대한 상세한 sectional views 제공
Image Deconvolution의 원리
Computational Approach
Image deconvolution은 종종 computational approach라고 불린다.
Point Spread Function(PSF)의 이해
기본 개념
빛의 파동 특성 때문에:
- Microscope lens system은 점 광원의 이미지를 작은 흐릿한 disc로 생성 (Figure 9-4 참조)
- 점 광원이 focal plane 위나 아래에 있으면 blurring이 증가
Point spread function(점 확산 함수):
- 점 광원의 이 흐릿한 이미지를 point spread function이라고 함
- Figure 9-29 참조
PSF를 이용한 Image 형성 이해
복잡한 객체의 이미지는 다음과 같이 생각할 수 있다:
- Three-dimensional specimen의 각 점을 해당하는 blurred disc로 교체
- 결과적으로 전체적으로 흐릿한(blurred) 이미지 생성
Deconvolution 과정
기본 원리
Computer program이 다음을 수행:
- 특정 현미경에서 점 광원의 측정된 point spread function 사용
- 이미지에 대한 blurring의 효과가 무엇이었을지 결정
- 동등한 “deblurring” (deconvolution) 적용
- 흐릿한 three-dimensional image를 일련의 깨끗한 optical sections으로 변환
제약사항
- Diffraction limit(회절 한계)에 의해 여전히 제약됨 → 없는 정보를 만들어내지 못한다는 뜻.
- 그러나 out-of-focus blur를 효과적으로 제거하여 각 광학 절편을 선명하게 만듦
Figure 9-23: Image Deconvolution 예시
실험 대상
Caenorhabditis elegans embryo(배아)의 light micrograph
염색
- Microtubules: 녹색 형광 표지
- Mitochondria: 빨간색 형광 표지
- DNA: 파란색 형광 표지
결과 비교
(A) Deconvolution 전
- 특정 초점 수준의 세부 사항이 표본의 out-of-focus levels에서 나온 빛으로 인해 흐릿함
(B) Deconvolution 후
- Three-dimensional stack of images의 deconvolution 후
- 동일한 초점 수준의 optical section이 훨씬 더 선명한 이미지를 보여줌
- 더 많은 contrast와 훨씬 감소된 blurring
Image Deconvolution의 장단점
장점
-
완전한 photon 수집
- Deconvolution systems에 사용되는 CMOS cameras는 방출되는 거의 모든 photon을 수집하는 데 매우 효율적
-
약한 표본에 적합
- 너무 약하게 염색된 표본에서도 상세한 three-dimensional images 생성 가능
- Confocal microscopy에 사용되는 밝은 빛으로 쉽게 손상되는 표본에 적합
-
낮은 광 노출
- 살아있는 세포를 장시간 관찰할 때 광 손상 최소화
단점 및 한계
두께 제한
- 표본 깊이 약 40 μm 이상에서는 빠르게 효과가 떨어짐
- 이는 confocal microscope(약 150 μm)보다 더 제한적
Confocal Microscopy와의 비교
Confocal microscopy가 더 나은 경우:
- High levels of out-of-focus light가 있는 두꺼운 표본(150 μm)
- 사용이 더 쉬움
- 최종 optical sections을 빠르게 볼 수 있음
Deconvolution이 더 나은 경우:
- 약하게 염색된 표본
- 밝은 빛에 민감한 표본
- 높은 photon 수집 효율이 필요한 경우
의료 영상과의 유사성
CT Scanner와의 비교
Image deconvolution과 confocal microscopy가 현미경 관찰자를 위해 하는 것: = CT (Computed Tomography) scanner가 방사선 전문의를 위해 하는 것
공통점:
- 온전한 구조의 내부에 대한 상세한 sectional views 제공
- 서로 다른 수단을 통해 동일한 목적 달성
재구성 원리
두 기술 모두:
- 여러 각도/깊이에서 데이터 수집
- Computer를 사용하여 three-dimensional 정보 재구성
- 내부 구조의 상세한 단면도 생성
요약
핵심 개념
Image deconvolution은:
- Computational method(계산적 방법)
- Point spread function을 이용하여 blur 제거
- 여러 깊이의 이미지를 선명한 optical sections으로 변환
주요 특징
- 비파괴적: 빛을 측정한 후 computer processing으로 처리
- 효율적 photon 수집: CMOS cameras 사용
- 약한 신호에 강함: 낮은 광량에서도 작동
- 제한된 두께: 약 40 μm까지 효과적
응용 분야
- 살아있는 세포의 three-dimensional imaging
- 약하게 염색된 표본의 고해상도 imaging
- 광 손상에 민감한 표본의 장기 관찰
- 세포 내 organelles와 구조의 3D 재구성
Figure 설명
Figure 9-23: Image Deconvolution
(A) Deconvolution 전의 Light Micrograph
- 표본: Caenorhabditis elegans embryo
- 염색:
- Microtubules: 녹색 형광 표지
- Mitochondria: 빨간색 형광 표지
- DNA: 파란색 형광 표지
- 문제점: 특정 초점 수준의 세부 사항이 표본의 out-of-focus levels에서 나온 빛으로 인해 흐릿함
(B) Deconvolution 후
- Three-dimensional stack of images의 deconvolution 수행
- 동일한 초점 수준의 optical section
- 개선사항:
- 훨씬 더 선명한 이미지
- 더 많은 contrast
- 훨씬 감소된 blurring
출처: D. Sage et al., Methods 115:28-41, 2017, doi 10.1016/j.ymeth.2016.12.015. With permission from Elsevier.
Figure 9-29: Point Spread Function (추가 참조)
Point spread function이 lens의 resolution을 결정한다:
(A) 3D Blurring
- 점 광원이 lens system으로 초점을 맞출 때
- Diffraction effects로 인해 점으로 imaging되지 않고 모든 차원에서 흐릿해짐
- Point spread function이 elongated(길쭉한) 형태
- 의미: XY축에서의 resolution이 Z축보다 우수
(B) Gaussian Distribution
- 이미지 평면에서 빛의 분포가 Gaussian distribution에 근사
- 이상적인 조건에서 half-maximum에서의 width는 약 200 nm
(C) Resolution Limit
- 약 200 nm 떨어진 두 개의 별도 점 광원
- 이미지에서 여전히 별도의 객체로 구별 가능
- 이보다 가까우면 이미지가 겹쳐서 분해 불가능
참고 문헌
- Chapter 9: Visualizing Cells and Their Molecules
- Section: “Imaging of Complex Three-dimensional Objects Is Possible with the Optical Microscope”
- Related Figures: 9-4, 9-23, 9-29
- Related Movie: Movie 9.1
- 관련 기술: Confocal Microscope