SMLM (Single-Molecule Localization Microscopy)
개요
Single-molecule localization microscopy는 개별 형광 분자의 정확한 위치를 결정하여 회절 한계를 극복하는 superresolution 기술이다. 약 20 nm의 resolution을 달성할 수 있어, conventional light microscopy보다 약 10배 향상된 성능을 보인다.
기본 원리
Single Molecule Imaging
단일 형광 분자가 이미지화되면, 약 200 nm 직경의 circular blurry disc로 나타난다. 그러나 충분한 photons가 이미지에 기여했다면, disc-like image의 정확한 수학적 중심을 매우 정확하게 결정할 수 있으며, 종종 몇 nanometers 이내로 형광 분자의 위치를 파악할 수 있다.
근접 분자 문제
표본에 많은 수의 인접한 형광 분자들이 포함되어 있을 때, 각각이 blurry, overlapping point spread functions를 이미지에 기여하여 어느 한 분자의 정확한 위치를 확인하는 것이 불가능해진다.
해결책: Sequential Activation
이 한계를 우회하는 방법은 매우 적은 수의 명확히 분리된 분자들만 한 번에 활발히 형광을 내도록 배치하는 것이다. 각각의 정확한 위치를 계산한 후, 후속 분자 세트들을 검사할 수 있다.
Figure 9-31: Single Fluorescent Molecules의 정확한 위치 결정
원리: 단일 형광 분자의 blurred image의 정확한 수학적 중심 결정은 이미지에 기여하는 photons가 많을수록 더 정확해진다.
Point spread function: 텍스트에서 설명된 point spread function은 molecular image의 크기가 약 200 nm 직경이 되도록 지시하지만, 매우 밝은 표본에서는 그 중심의 위치를 nanometer 이내로 정확히 찾을 수 있다.
SMLM의 작동 메커니즘
Photoswitchable Labels 사용
실제로 이는 lasers를 사용하여 switchable fluorescent labels가 포함된 표본에서 sparse subset의 형광 분자들을 순차적으로 전환함으로써 달성할 수 있다. 현재 수백 가지의 그러한 labels가 있으며, 세 가지 클래스로 나뉜다:(이 세가지 종류 모두 쓰긴 한다고 함)
- Photoactivated labels: 예를 들어 dark에서 green으로 전환
- Photoconvertible labels: 예를 들어 green에서 red로 전환
- Photoswitchable labels: 앞뒤로 전환
Activation Process
Labels는 예를 들어 near-ultraviolet light로 조명하여 활성화되며, 이는 작은 subset의 분자들을 수정하여 다른 파장의 excitation beam에 노출될 때 형광을 내도록 한다. 이들은 switching off하여 형광을 quenching하기 전에 excitation에 반응하여 각각 수천 개의 photons를 방출하며, switching process는 수만 또는 수십만 번까지 반복될 수 있어 매우 큰 단일 분자 세트의 정확한 좌표를 결정할 수 있다.
Image Reconstruction
전체 세트를 결합하여 계산된 각 개별 분자의 위치가 정확히 표시된 이미지로 디지털 표시할 수 있다.
Figure 9-32: Single-Molecule Localization Microscopy (SMLM)
(A) SMLM의 원리
가상의 표본에서: Sparse subsets의 형광 분자들이 개별적으로 짧게 켜진 후 bleached됨. 이러한 모든 잘 분리된 분자들의 정확한 위치를 점진적으로 함께 추가하여 superresolution에서 이미지로 구축할 수 있다.
Sequential cycles: 활성화와 bleaching의 연속적인 cycles가 잘 분리된 단일 형광 분자를 검출할 수 있게 함
Image building: 수만 개의 연속적인 작은 분자 그룹들의 위치가 map에 추가됨에 따라 형광 구조의 superresolution 이미지가 구축됨
(B) TIRF와 PALM/STORM 비교
세포의 일부에서 microtubules가 형광으로 표지되어 TIRF microscope(왼쪽)와 superresolution PALM microscope(오른쪽)에서 이미지화됨.
왼쪽 (TIRF): 각 microtubule의 직경이 blurred diffraction-limited image에서 250 nm 오른쪽 (PALM): 각 microtubule의 직경이 이제 실제 크기인 약 25 nm와 유사함
SMLM의 주요 특징
1. 극도로 높은 Resolution
20 nm까지 도달: Conventional light microscopy의 10배 향상 실제 크기 반영: 25 nm microtubule이 25 nm로 보임 (250 nm가 아님)
2. Sequential Activation 의존
시간 소요: 수만~수십만 번의 activation cycles 필요 Photon 수집: 각 분자당 수천 개의 photons
3. Computational Intensity
정확한 위치 계산: 각 단일 분자의 수학적 중심 계산 Image reconstruction: 수만 개의 위치를 하나의 이미지로 결합
SMLM의 장점
- 높은 Resolution: ~20 nm (10배 향상)
- 정확한 위치 정보: Nanometer 수준의 정밀도
- 실제 크기 반영: True molecular dimensions 가시화
- 정량적 분석: 개별 분자 counting 가능
SMLM의 한계
- 긴 Acquisition Time: 수만~수십만 번의 cycles
- 특수 Labels: [[# SMLM (Single-Molecule Localization Microscopy)#^c7bd0d|Photoswitchable probes]] 필요
- Dense Labeling 필요: 충분한 분자 밀도
- Live Cell 어려움: 긴 시간으로 인한 제약
기술적 요구사항
Photoswitchable Labels
다양한 Labels: 수백 가지 사용 가능 세 가지 클래스: Photoactivated, photoconvertible, photoswitchable 높은 Photon Yield: 분자당 수천 개의 photons 방출
Imaging System
고감도 Detection: 단일 분자 감지 정밀한 Control: Activation과 excitation의 정확한 타이밍 Stable System: 긴 acquisition 동안 안정성
Computational Resources
Large Data Sets: 수만~수십만 개의 이미지 복잡한 Algorithms: 분자 위치 계산 Image Reconstruction: 최종 superresolution 이미지 생성
응용 분야
Cytoskeleton
Microtubules: 실제 직경(25 nm) 측정 (Figure 9-32B) Actin Filaments: Branching patterns, organization Intermediate Filaments: Network architecture
Membrane Structures
Receptor Clustering: Nanoscale organization Lipid Domains: Membrane heterogeneity Protein Complexes: Stoichiometry와 arrangement
Nuclear Structures
Chromatin Organization: Nanoscale packaging Nuclear Pores: Detailed architecture Transcription Sites: Molecular organization
다른 Superresolution 기술과 비교
vs Structured Illumination Microscopy: SIM은 더 빠르고(초-분 단위) 모든 dyes 사용 가능하지만 100 nm 제한. SMLM은 20 nm까지 가능하지만 분-시간 단위 소요.
vs Stimulated Emission Depletion: 둘 다 ~20 nm resolution. STED는 point-by-point scanning, SMLM은 wide-field imaging 후 reconstruction.
vs Confocal Microscope: Confocal은 ~200 nm, 빠름, 3D 가능. SMLM은 ~20 nm이지만 느리고 주로 2D (단, 3D 가능한 변형도 있음).
SMLM의 변형 기술
3D SMLM
Astigmatism: Cylindrical lens로 z-position 결정 Biplane: 두 focal planes에서 동시 imaging Light Sheet: Z-sectioning과 결합
Multi-color SMLM
여러 Probes: 다른 색상의 photoswitchable probes Sequential Imaging: 각 color channel을 순차적으로 Spectral Unmixing: Emission spectra 기반 분리
데이터 분석
Localization Precision
정확도: 일반적으로 10-20 nm Photon 의존성: 더 많은 photons = 더 높은 정확도 Background 영향: 낮은 background가 중요
Molecule Counting
Quantification: 개별 분자 수 계산 Stoichiometry: Protein complex 조성 Clustering Analysis: 분자들의 spatial organization
요약
핵심 원리: 단일 형광 분자의 정확한 위치를 순차적으로 결정하여 회절 한계 극복, nanometer 정밀도로 superresolution 이미지 구축 주요 기술: Photoswitchable labels의 sequential activation, 각 분자의 수학적 중심 계산, 수만-수십만 위치의 디지털 결합 Resolution: 약 20 nm (실제 분자 크기 반영) 장점: 극도로 높은 resolution, 정확한 위치 정보, 정량적 분석 가능 한계: 긴 acquisition time, 특수 labels 필요, live cell imaging 제약 응용: Cytoskeleton structure, membrane organization, nuclear architecture, protein complex stoichiometry
참고 문헌
Chapter 9: Visualizing Cells and Their Molecules, Section: “Single-Molecule Localization Microscopy Also Delivers Superresolution”, Related Figures: 9-31, 9-32, Related concepts: deconvolution, Structured Illumination Microscopy, Stimulated Emission Depletion, Confocal Microscope