Detergent
Detergent는 hydrophobic association을 파괴하고 lipid bilayer를 disassemble하여 Membrane protein을 가용성 형태로 방출할 수 있는 유일한 agent이다. 이는 small amphiphilic molecule로 가변적인 구조를 가진다.
구조적 특성
Detergent는 lipid보다 물에 훨씬 더 잘 녹는다.
Polar End의 종류
Polar (hydrophilic) end는 두 가지 type이 있다:
Ionic (charged):
- 예: Sodium dodecyl sulfate (SDS)
- Anionic detergent
- 강한 ionic detergent
Nonionic (uncharged):
- 예: β-octylglucoside, Triton X-100
- 온화한 detergent
- Triton X-100은 혼합물로, bracket으로 표시된 region이 9-10회 반복됨
위 그림 (A)는 세 가지 commonly used detergent를 보여준다. 각 detergent의 hydrophobic portion은 노란색, hydrophilic portion은 주황색으로 표시되어 있다.
Critical Micelle Concentration (CMC)
CMC 이하
- 낮은 농도에서 detergent molecule은 용액에서 단량체
- Detergent molecule이 개별적으로 분산됨
CMC에서
- Concentration이 threshold (CMC)를 넘어 증가하면
- Detergent molecule이 aggregate하여 Micelle 형성
CMC 이상
위 그림 (B)는 detergent concentration과 micelle 형성의 관계를 보여준다:
- CMC 이상에서 detergent monomer 농도는 일정하게 유지됨
- Micelle 수만 증가함
동적 행동:
- Detergent molecule이 빠르게 micelle로 확산해 들어가고 나옴
- Monomer 농도를 일정하게 유지
- Micelle 수와 관계없음
CMC와 Micelle 특성
각 detergent의 특징적 특성:
- CMC
- Micelle 내 평균 detergent molecule 수
이들은 다음에 의존:
- 온도
- pH
- 염 농도
결과: Detergent 용액은 복잡한 system이며 연구하기 어렵다.
Micelle 형성
분자 모양
위 그림 (C)는 detergent molecule이 cone-shaped이기 때문에 bilayer가 아닌 micelle을 형성함을 보여준다.
Amphiphilic 특성:
- Polar와 nonpolar end를 모두 가짐
- Cone-shaped이기 때문에 Micelle 형성
Micelle 구조
위 그림 (D)는 molecular dynamics calculation으로 예측한 20개의 β-octylglucoside molecule로 구성된 micelle의 snapshot을 보여주는 space-filling model이다:
- Head group은 빨간색
- Hydrophobic tail은 회색
- Hydrophobic region이 일시적으로 노출됨
실제 구조:
- Detergent micelle은 끊임없이 변화하는 불규칙한 모양을 가진다고 생각됨
- Packing constraint로 인해 hydrophobic tail이 부분적으로 물에 노출됨
Membrane Protein 가용화
메커니즘
Detergent가 membrane과 섞이면:
-
Hydrophobic end의 결합
- Detergent의 hydrophobic end가 membrane protein의 hydrophobic region에 결합
- Lipid molecule을 치환하여
- Detergent molecule의 collar로 protein을 둘러쌈
-
Protein 가용화
- Detergent의 다른 end가 polar이기 때문에
- Membrane protein을 용액으로 가져오는 경향
- Detergent-protein complex 형성
-
Lipid molecule 일부 유지
- 보통 일부 lipid molecule도 protein에 부착된 채로 남음
위 그림은 mild nonionic detergent로 membrane protein을 가용화하는 과정을 보여준다. Detergent가 Lipid bilayer를 파괴하고 protein을 protein-lipid-detergent complex로 용액에 가져온다. Membrane의 Phospholipid도 lipid-detergent micelle로 가용화된다.
Detergent의 종류와 용도
Strong Ionic Detergent (예: SDS)
특성:
- 가장 hydrophobic한 membrane protein도 가용화 가능
- Membrane protein의 SDS polyacrylamide-gel electrophoresis 분석 허용
단점:
- Protein의 internal hydrophobic core를 파괴하여 unfold (denature)
- Protein을 inactive하고 기능 연구에 사용 불가능하게 만듦
사용 후:
- Protein을 SDS-denatured form으로 쉽게 분리 및 정제 가능
- 일부 경우 SDS 제거로 정제된 protein이 renature
- Functional activity 회복 가능
Mild Detergent
많은 membrane protein은 mild detergent 사용으로 active form으로 가용화 및 정제 가능하다:
작용:
- Lipid 제거 후 노출된 membrane-spanning segment의 hydrophobic region을 cover
- Protein을 unfold하지 않음
중요 사항:
- Multipass transmembrane protein과 작업할 때
- 종종 lipid의 thin layer를 유지하는 것이 중요
- Detergent extraction 후 protein activity 유지를 위해
Detergent 농도 감소 시:
- Solubilized membrane protein이 용해 상태로 남지 않음
- 과량의 Phospholipid molecule이 존재하면
- Membrane protein이 자발적으로 형성되는 small liposome에 incorporate됨
Functional Reconstitution
위 그림은 mild nonionic detergent를 사용하여 기능적 membrane protein system을 가용화, 정제, 재구성하는 과정을 보여준다:
예시: Na⁺-K⁺ pump
- Detergent로 membrane 가용화
- Functional Na⁺-K⁺ pump molecule 정제
- Phospholipid vesicle에 incorporate
- 이 pump는 대부분의 동물 세포 plasma membrane에 존재
- ATP hydrolysis의 energy를 사용하여:
- Na⁺를 세포 밖으로 pump
- K⁺를 세포 안으로 pump
의의:
- Functionally active membrane protein system을 정제된 성분으로부터 재구성
- Membrane transporter, ion channel, signaling receptor 등의 activity 분석에 강력한 수단
- 특정 세포 기능에 어떤 protein이 필요하고 충분한지 결정 가능
증명 예:
- ATP synthase가 H⁺ gradient를 사용하여 ATP를 만든다는 가설 증명
- Mitochondrial, chloroplast, bacterial membrane에서
Nanodisc
Membrane protein은 detergent 용액에서 nanodisc로 재구성될 수도 있다:
구조:
- 작고 균일한 크기의 membrane patch
- Protein belt로 둘러싸임
- Belt가 bilayer의 노출된 edge를 cover하여 patch를 용액에 유지
Belt protein:
- High-density lipoprotein (HDL)로부터 유래
- 정상 기능: 혈액에서 transport를 위해 lipid를 가용성으로 유지
장점:
- Native lipid environment에서 membrane protein 연구 가능
- Bilayer 양쪽에서 실험적으로 접근 가능
- Ligand-binding experiment에 유용
- Single-particle electron microscopy로 구조 분석 가능
- Protein crystallization 필요 없음
결과:
- Membrane protein과 protein complex의 3차원 구조가 알려진 수가 빠르게 증가
- 여전히 water-soluble protein의 알려진 구조보다는 적음