Confocal Microscope
개요
Confocal microscope(공초점 현미경)는 deconvolution과 유사한 결과를 얻지만, 측정 전에 빛을 조작하는 방식으로 작동한다. 이는 디지털 기술이 아닌 아날로그 기술이다. Confocal microscope의 광학적 세부사항은 복잡하지만, 기본 개념은 단순하며(Figure 9-24 참조), 그 결과는 기존 광학 현미경보다 훨씬 우수하다.
작동 원리
기본 구성
Confocal microscope는 일반적으로 fluorescence optics(형광 광학계)와 함께 사용된다(Figure 9-10C 참조). 그러나 일반적인 방식처럼 전체 표본을 한 번에 조명하는 대신, 광학 시스템은 순간적으로 표본 내 특정 깊이의 단일 지점에 빛의 점을 집속한다.
Pinpoint Illumination(점 조명)
- 광원: 일반적으로 pinhole(핀홀)을 통과한 laser 빛으로 제공
- 형광 수집: 조명된 물질에서 방출된 형광이 적절한 light detector에 수집되어 이미지 생성
- Confocal aperture: Detector 앞에 pinhole aperture가 배치되며, 이는 조명 pinhole과 confocal(공초점) 위치에 있음
- 즉, 표본 내 조명된 지점에서 방출된 광선이 초점을 맞추는 정확한 위치에 있음
- 따라서 표본의 이 지점에서 나온 빛은 이 aperture에 수렴하여 detector로 들어감
Out-of-focus Light의 제거
- 표본의 초점이 맞지 않는 영역에서 방출된 빛은 pinhole aperture에서도 초점이 맞지 않음
- 따라서 이러한 빛은 detector에서 대부분 제외됨
- 이를 통해 out-of-focus blur(초점이 맞지 않는 흐릿함)가 제거되어 선명한 optical section(광학 절편)을 얻을 수 있음
Scanning(주사) 과정
- Two-dimensional image를 구축하기 위해 초점 평면의 각 지점에서 데이터가 순차적으로 수집됨
- 한쪽에서 다른 쪽으로 일정한 pixel 패턴으로 field를 가로질러 scanning
- 데이터는 computer screen에 표시됨
실제 구현
Figure 9-24에는 표시되지 않았지만, scanning은 일반적으로 다음과 같이 수행된다:
- Dichroic (beam-splitting) mirror와 objective lens 사이에 배치된 oscillating mirror(진동 거울)로 beam을 편향
- 조명 spot과 detector의 confocal pinhole이 엄격하게 정렬된 상태를 유지
- 디자인의 변형으로 video rate(비디오 속도)로 빠른 데이터 수집 가능
응용 분야
Confocal microscope는 다음과 같은 다양한 구조 해상에 사용되어 왔다:
- Cytoskeletal fibers의 networks
- Organelles의 dynamics(역학)
- Nucleus 내 chromosomes와 genes의 배열
Three-dimensional Imaging(3차원 영상화)
서로 다른 깊이에서 촬영한 일련의 optical sections을 computer에 저장하면 three-dimensional image를 재구성할 수 있다(Movie 9.1 참조).
Figure 9-25: Confocal Microscopy의 응용 예시
Figure 9-25A: 육식성 수생 식물 Utricularia gibba의 정교한 컵 모양 포획기
- Cell walls용 fluorescent label을 사용한 452개의 개별 confocal images stack을 조합하여 이미지 생성
Figure 9-25B: Optical sections의 stack에서 객체 재구성 가능
- 훨씬 다른 규모에서 단일 살아있는 yeast cell의 mitochondrial compartment의 복잡한 분기 구조를 보여줌
Deconvolution Methods와의 비교
Confocal Microscopy의 장점
- 두꺼운 표본에 더 적합: High levels of out-of-focus light가 있는 두꺼운 표본에 일반적으로 더 우수
- 사용 용이성: Deconvolution systems보다 일반적으로 사용이 더 쉬움
- 빠른 결과: 최종 optical sections을 빠르게 볼 수 있음
Deconvolution의 장점
- Photon 수집 효율: Deconvolution systems에 사용되는 CMOS cameras는 방출되는 거의 모든 photon을 수집하는 데 매우 효율적
- 약한 표본에 적합: 너무 약하게 염색되었거나 confocal microscopy에 사용되는 밝은 빛으로 쉽게 손상되는 표본에서 상세한 three-dimensional images를 만드는 데 사용 가능
제한사항
두께 제한
두 방법 모두 매우 두꺼운 표본을 다루는 데 한계가 있다:
- Deconvolution methods: 표본 깊이 약 40 μm 이상에서는 빠르게 효과가 떨어짐
- Confocal microscopes: 최대 약 150 μm 깊이까지만 이미지를 얻을 수 있음
➡Multiphoton Microscopy가 대안Multiphoton Microscopy
개선된 방법: Multiphoton Microscopy
특수 현미경들은 fluorescent molecules가 여기되는 방식을 활용하여 표본 내 더 깊이 탐사할 수 있다.
Two-photon Effect(2광자 효과)
기본 원리:
- Fluorescent molecules는 일반적으로 방출되는 빛보다 짧은 파장의 single high-energy photon에 의해 여기됨
- 추가로 두 개(또는 그 이상)의 lower energy photons의 흡수로도 여기 가능
- 단, 두 photons가 femtosecond 이내에 도착해야 함
장점:
- Background noise 감소: Longer-wavelength excitation 사용
- 더 깊은 침투: Red 또는 near-infrared light는 표본 내 더 깊이 침투 가능
- 세포 손상 감소: Infrared laser light는 visible light보다 살아있는 세포에 덜 손상을 줌
성능:
- Multiphoton microscopes는 때때로 표본 내 0.5 millimeter 깊이에서도 선명한 이미지 획득 가능
- 살아있는 조직 연구에 특히 가치 있음
- 특히 살아있는 뇌 표면 바로 아래 synapses와 neurons의 dynamic activity imaging에 유용
Figure 9-26: Multiphoton Imaging 예시
Multiphoton imaging
살아있는 마우스 뇌 피질 내부 거의 0.5 mm까지 볼 수 있다:
- Calcium 농도에 따라 형광이 변하는 dye 사용
- Dendritic spines(빨간색)의 active synapses(노란색)를 보여줌
- 시간의 함수로 변화를 추적 (이 경우 각 이미지 사이에 하루 간격)
- Infrared laser light 사용으로 가능
Link to original
Multiphoton Microscopy
개선된 방법: Multiphoton Microscopy
특수 현미경들은 fluorescent molecules가 여기되는 방식을 활용하여 표본 내 더 깊이 탐사할 수 있다.
Two-photon Effect(2광자 효과)
기본 원리:
- Fluorescent molecules는 일반적으로 방출되는 빛보다 짧은 파장의 single high-energy photon에 의해 여기됨
- 추가로 두 개(또는 그 이상)의 lower energy photons의 흡수로도 여기 가능
- 단, 두 photons가 femtosecond 이내에 도착해야 함
장점:
- Background noise 감소: Longer-wavelength excitation 사용
- 더 깊은 침투: Red 또는 near-infrared light는 표본 내 더 깊이 침투 가능
- 세포 손상 감소: Infrared laser light는 visible light보다 살아있는 세포에 덜 손상을 줌
성능:
- Multiphoton microscopes는 때때로 표본 내 0.5 millimeter 깊이에서도 선명한 이미지 획득 가능
- 살아있는 조직 연구에 특히 가치 있음
- 특히 살아있는 뇌 표면 바로 아래 synapses와 neurons의 dynamic activity imaging에 유용
Figure 9-26: Multiphoton Imaging 예시
Multiphoton imaging
살아있는 마우스 뇌 피질 내부 거의 0.5 mm까지 볼 수 있다:
- Calcium 농도에 따라 형광이 변하는 dye 사용
- Dendritic spines(빨간색)의 active synapses(노란색)를 보여줌
- 시간의 함수로 변화를 추적 (이 경우 각 이미지 사이에 하루 간격)
- Infrared laser light 사용으로 가능
Figure 설명
Figure 9-24: Confocal Fluorescence Microscope
Fig. 9-24
(A) 기본 구성도
- Standard fluorescence microscope(Figure 9-10C 참조)와 유사한 광학 구성요소의 기본 배열
- 차이점: Laser를 사용하여 small pinhole을 조명하며, 그 이미지가 three-dimensional (3D) 표본의 단일 지점에 집속됨
(B) 형광 방출
- 표본의 이 focal point에서 방출된 형광이 두 번째 (confocal) pinhole에 집속됨
(C) Out-of-focus light 제거
- 표본의 다른 곳에서 방출된 빛은 pinhole에서 초점이 맞지 않음
- 따라서 최종 이미지에 기여하지 않음
- 표본을 가로질러 light beam을 scanning함으로써
- 정확한 초점 평면의 매우 선명한 two-dimensional image가 구축됨
- 표본의 다른 영역에서 나온 빛으로 인해 크게 저하되지 않음
(D) 상업용 버전
- Laser scanning confocal microscopes의 상업용 버전은 upright 및 inverted microscopes 모두에 구성 가능
- 표준 upright confocal microscope를 보여줌
Figure 9-25: Confocal Fluorescence Microscopy의 3D 데이터
(A) Utricularia gibba 포획기
- 육식성 수생 식물의 정교한 컵 모양 trap
- Cell walls용 fluorescent label을 사용한 452개의 개별 confocal images stack을 조합하여 이미지 제작
(B) 3D 재구성
- Optical sections의 stack에서 객체 재구성 가능
- 단일 살아있는 yeast cell의 mitochondrial compartment의 복잡한 분기 구조
- 훨씬 다른 규모에서의 예시
Figure 9-26: Multiphoton Imaging
살아있는 마우스 뇌 피질 내부 거의 0.5 mm를 볼 수 있다:
- 기술: Two-photon effect
- Fluorochrome이 single high-energy photon 대신 두 개의 coincident infrared photons로 여기될 수 있음
- 사용된 염료: Calcium 농도에 따라 형광이 변하는 dye
- 관찰 내용:
- Dendritic spines(빨간색)의 active synapses(노란색) 표시
- 시간의 함수로 변화 (각 이미지 사이에 하루 간격)
- 장점:
- Infrared laser light가 visible light보다 살아있는 세포에 덜 손상
- 더 깊이 침투하여 현미경 관찰자가 살아있는 조직 내부를 더 깊이 들여다볼 수 있음
참고 문헌
- Chapter 9: Visualizing Cells and Their Molecules
- Section: “The Confocal Microscope Produces Optical Sections by Excluding Out-of-Focus Light”
- Related Figures: 9-24, 9-25, 9-26
- Related Movie: Movie 9.1