FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)
개요
FRAP는 GFP에 융합된 관심 단백질을 활용하여 단백질의 dynamics를 연구하는 또 다른 방법이다. 이 기술은 형광을 선택적으로 소멸시킨 후, 그 영역으로 형광 분자가 이동해 들어오는 과정을 분석한다.
FRAP의 원리
기본 개념
Photobleaching(광표백):
- Laser의 강한 집속 빛(strong focused beam of light)을 사용
- 세포의 특정 영역에서 GFP 형광을 소멸(extinguish)시킴
Recovery(회복) 관찰:
- 소멸되지 않은 나머지 형광 단백질 분자들의 이동 분석
- 표백된 영역(bleached area)으로 들어오는 방식을 시간의 함수로 분석
작동 메커니즘
1단계: Photobleaching
과정:
- Laser의 강한 집속 빛을 세포의 지정된 영역에 조사
- 해당 영역의 형광 단백질 분자들의 형광 소멸
- 주변 영역의 형광 단백질은 영향받지 않음
2단계: Recovery Monitoring
관찰:
- 표백되지 않은 형광 단백질 분자들이 표백 영역으로 이동
- 시간 경과에 따른 형광 회복 측정
- 회복 속도와 정도 정량화
3단계: 데이터 분석
추출 가능한 정보:
- 이동 속도 (diffusion coefficients)
- Active transport rates
- 다른 단백질과의 결합 및 해리 속도 (binding and dissociation rates)
Figure 9-20: FRAP의 실험 과정
(A) 실험 이미지
시스템:
- 배양된 포유류 세포
- CD86 발현: integral membrane protein
- Fluorescent protein에 융합
CD86의 생물학적 역할:
- Antigen-presenting cells의 plasma membrane에 존재
- Co-stimulatory protein
- T cells의 활성화에 필요 (Figure 24-34 참조)
실험 과정:
- Plasma membrane의 작은 영역을 선택적으로 photobleaching
- 나머지 형광 분자들이 membrane의 평면 내에서 빠르게 확산
- 표백된 영역을 채움
- 시간의 함수로 회복 추적
(B) 실험 개략도
도식적 표현:
- (A)에 표시된 실험의 단계별 설명
- Photobleaching 전, 중, 후의 상태
- 형광 분자들의 이동 방향 표시
(C) Fluorescence Recovery Curve
그래프 분석:
- X축: 시간 (time)
- Y축: 표백 영역의 형광 강도 (fluorescence intensity)
정량적 데이터 추출:
-
회복 속도 (Rate of recovery)
- 곡선의 기울기
- 분자 이동 속도 반영
-
Mobile fraction(이동 가능 분획)
- 최종적으로 회복된 형광의 비율
- 이동 가능한 단백질 분자의 비율
-
Immobile fraction(이동 불가 분획)
- 회복되지 않은 형광의 비율
- 고정되어 있거나 매우 느리게 이동하는 분자들
측정 가능한 Kinetic Parameters
1. Diffusion Coefficients (확산 계수)
의미:
- 단백질이 자유롭게 확산하는 속도
- 분자의 크기와 환경의 점성도 반영
응용:
- Membrane fluidity 평가
- Protein-lipid interactions
- Cytoplasmic viscosity 측정
2. Active Transport Rates
의미:
- 능동적으로 운반되는 속도
- Motor proteins에 의한 이동
응용:
- Vesicle trafficking
- Organelle movement
- Directed protein transport
3. Binding and Dissociation Rates
의미:
- 다른 단백질이나 구조물과의 결합/해리 속도
- 상호작용의 역학
응용:
- Protein-protein interactions
- DNA-protein binding
- Cytoskeleton association
FRAP의 장점
1. 정량적 분석
측정 가능:
- 회복 속도의 정확한 측정
- Mobile/immobile fractions의 비율
- 다양한 kinetic parameters
2. 살아있는 세포에서 관찰
In vivo 연구:
- 생리적 조건 유지
- 실시간 dynamics
- 자연스러운 세포 환경
3. 비침습적 (초기 표백 제외)
최소한의 교란:
- 표백 후에는 정상적인 세포 기능 유지
- 장시간 관찰 가능
- 반복 실험 가능 (다른 영역)
4. 다양한 적용 가능
광범위한 응용:
- 막 단백질
- 세포질 단백질
- 핵 단백질
- 세포소기관 단백질
생물학적 응용
Membrane Protein Dynamics
연구 대상:
- Lateral diffusion in membranes
- Membrane domain organization
- Lipid raft association
- Receptor clustering
예시 (Figure 9-20):
- CD86의 plasma membrane 내 확산
- 빠른 lateral mobility 확인
- Membrane fluidity 평가
Nuclear Protein Dynamics
연구 대상:
- Nucleocytoplasmic shuttling
- Chromatin binding
- Transcription factor dynamics
- DNA repair protein recruitment
Cytoskeletal Dynamics
연구 대상:
- Actin turnover
- Microtubule dynamics
- Intermediate filament exchange
- Motor protein movement
Organelle Proteins
연구 대상:
- ER resident proteins
- Golgi trafficking
- Mitochondrial protein import
- Peroxisomal dynamics
실험적 고려사항
Photobleaching 조건
최적화 필요:
- Laser 강도: 충분히 표백하되 세포 손상 최소화
- 표백 시간: 빠르게 완료
- 표백 영역 크기: 분석 목적에 맞게 조절
시간 해상도
Trade-off:
- 빠른 회복: 높은 시간 해상도 필요
- 느린 회복: 장시간 imaging
- 추가 photobleaching 최소화
형광 강도
고려사항:
- 초기 형광 강도 충분해야 함
- 표백 후 회복 측정 가능한 수준
- Signal-to-noise ratio 확보
FRAP vs 다른 기술
vs Photoactivation
공통점:
- 단백질 dynamics 연구
- 시간에 따른 변화 추적
- Kinetic parameters 측정
차이점:
| 특성 | FRAP | Photoactivation |
|---|---|---|
| 초기 신호 | 감소 (표백) | 증가 (활성화) |
| 추적 방향 | 밖에서 안으로 | 안에서 밖으로 |
| 측정 | 회복 속도 | 이동/분산 |
vs FRET
FRET:
- 단백질 간 상호작용
- 거리 의존적 (5 nm 이내)
- 실시간 결합 관찰
FRAP:
- 단백질의 이동성
- 결합/해리 kinetics
- 전체 mobility 평가
데이터 해석
Recovery Curve의 분석
완전 회복 (100%):
- 모든 분자가 mobile
- 자유로운 확산
- 안정적 결합 없음
부분 회복 (~50-90%):
- Mobile fraction 존재
- 일부 immobile fraction
- 일시적 결합 또는 구조적 제약
낮은 회복 (<50%):
- 대부분 immobile
- 강한 결합 또는 고정
- 구조적 구성 요소
Recovery Rate 해석
빠른 회복 (초 단위):
- 자유 확산
- 약한 상호작용
- 유동적 환경
느린 회복 (분 단위):
- 제한된 확산
- 강한 상호작용
- 점성 높은 환경
매우 느린 회복 (시간 단위):
- 매우 제한적 이동
- 매우 강한 결합
- 구획화된 환경
기술적 발전
Improved Imaging Systems
고감도 detectors:
- 낮은 형광 강도에서도 측정
- 빠른 acquisition
- 낮은 광독성
Multiple ROI FRAP
동시 다중 영역:
- 여러 위치 동시 표백
- 비교 분석 용이
- 실험 효율 증가
Automated Analysis
소프트웨어 발전:
- 자동 curve fitting
- Kinetic parameter 자동 계산
- 통계 분석 통합
요약
핵심 원리
- 선택적 photobleaching 후 형광 회복 관찰
- 시간에 따른 분자 이동 정량화
- Kinetic parameters 측정
주요 장점
- 정량적 분석
- 살아있는 세포에서 관찰
- 다양한 kinetic 정보
- 광범위한 응용
측정 가능한 정보
- Diffusion coefficients
- Active transport rates
- Binding/dissociation kinetics
- Mobile/immobile fractions
생물학적 의의
- Membrane dynamics
- Protein-protein interactions
- Cytoskeletal dynamics
- Organelle protein behavior
참고 문헌
- Chapter 9: Visualizing Cells and Their Molecules
- Section: “Protein Dynamics Can Be Followed in Living Cells”
- Related Figure: 9-20, 24-34
- Related Movie: Movie 10.6
- Related techniques: FRET, Photoactivation
- Related concept: Fluorescent Proteins(GFP, GFP tagging)