FRET (Förster Resonance Energy Transfer)
개요
Fluorescent proteins는 이제 단순히 세포 내 특정 단백질의 위치를 확인하는 것을 넘어, kinetic properties(동역학적 특성)를 밝히고 다른 분자들과의 상호작용 여부를 파악하는 데 활용된다. FRET는 이러한 목적으로 사용되는 강력한 기술이다.
FRET의 정의
Förster Resonance Energy Transfer 또는 Fluorescence Resonance Energy Transfer
- 두 명칭 모두 FRET로 약칭됨
- 단백질 간 상호작용을 모니터링하는 기술
작동 원리
기본 구성
두 분자 표지:
- 관심 있는 두 분자를 각각 다른 fluorochrome으로 표지
- Fluorochrome 선택 기준:
- **Donor(공여체)**의 emission spectrum(방출 스펙트럼)
- **Acceptor(수용체)**의 absorption spectrum(흡수 스펙트럼)
- 두 스펙트럼이 overlap(겹침)해야 함
Energy Transfer 메커니즘
조건:
- 두 단백질이 상호작용하여 fluorochromes가 매우 가까운 근접 거리(약 5 nm 이내)로 접근
과정:
- 첫 번째 fluorochrome(donor)이 여기(excited)됨
- 흡수된 빛으로부터 에너지를 직접 다른 fluorochrome으로 전달
- 비방사적(nonradiatively) 전달 - resonance(공명)에 의해
- 결과: 첫 번째 fluorochrome의 excitation wavelength(여기 파장)로 조명하면
- 두 번째 fluorochrome의 emission wavelength(방출 파장)에서 형광 생성
Figure 9-19: Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
실험 설계
목적: 세포 내에서 두 단백질이 상호작용하는지(그리고 언제 상호작용하는지) 결정
준비:
- GFP의 서로 다른 색상 변이형에 부착된 fusion proteins로 먼저 생성
(A) FRET 시스템 구성
Protein X:
- Blue fluorescent protein에 연결
- Violet light(자색광)로 여기
- Blue light(청색광) 방출
Protein Y:
- Green fluorescent protein에 연결
- Blue light로 여기
- Green light(녹색광) 방출
(B) 상호작용 없을 때
실험 조건:
- Protein X와 Y가 상호작용하지 않음
- Violet light로 샘플 조명
결과:
- Blue fluorescent protein에서만 형광 발생
- Green fluorescent protein 형광 없음
(C) 상호작용 시 FRET 발생
실험 조건:
- Protein X와 protein Y가 상호작용
- Violet light로 샘플 조명
결과:
- Blue fluorescent protein이 여기됨
- Resonance transfer of energy(공명 에너지 전달) 발생
- 에너지가 green fluorescent protein으로 전달
- Green light 방출
중요 조건:
- Fluorochromes가 매우 가까워야 함
- 약 1-5 nm 이내
- 모든 protein X와 Y 분자가 항상 결합되어 있는 것은 아니므로 일부 blue light는 여전히 검출 가능
동적 변화 관찰:
- 두 단백질이 상호작용하기 시작하면:
- Donor blue fluorescent protein의 방출 감소
- Acceptor GFP의 방출 증가
FRET 측정
Donor Fluorescence 감소 정량화
측정 방법:
- Acceptor 존재 시 donor fluorescence의 감소를 정량화
- 이를 통해 FRET 효율 측정
거리 의존성
FRET efficiency(FRET 효율):
- Donor와 acceptor 분자 사이 거리의 6제곱에 반비례
- 매우 작은 거리 변화에 극도로 민감
수식:
FRET efficiency ∝ 1/(distance)^6
응용 분야
1. Signaling Molecule과 Receptor의 상호작용
참고: Figure 15-49
- Signaling molecules와 그들의 receptors 간 상호작용 모니터링
- 신호 전달 과정의 실시간 추적
2. Macromolecular Complexes 내 단백질
용도:
- 살아있는 세포 내 특정 위치에서
- Macromolecular complexes 내 단백질들의 상호작용 모니터링
3. GFP 변이형 사용
장점:
- GFP의 서로 다른 spectral variants를 fluorochromes로 사용
- 다양한 조합 가능
- 살아있는 세포에서 직접 관찰 가능
핵심 특징
1. 비침습적 관찰
- 살아있는 세포에서 실시간 모니터링
- 세포 손상 최소화
2. 높은 공간 해상도
- 1-5 nm 범위의 분자 간 거리 측정
- 일반 광학 현미경(회절 한계 약 200 nm)보다 훨씬 높은 해상도
3. 동적 정보
- 단백질 상호작용의 시작과 종료 추적
- 상호작용의 강도 변화 측정
4. 정량적 분석
- FRET 효율 측정을 통한 정량적 데이터 획득
- 결합 친화도 및 해리 상수 계산 가능
제한사항
1. 거리 제한
- 약 1-5 nm 범위에서만 효과적
- 이 범위를 벗어나면 FRET 신호 급격히 감소
2. Spectral Overlap 요구
- Donor의 emission과 acceptor의 excitation이 겹쳐야 함
- 적절한 fluorophore 쌍 선택 필요
3. 분자 배향 의존성
- Fluorophores의 상대적 배향도 FRET 효율에 영향
- 완벽한 정량화가 어려울 수 있음
요약
FRET는
- 단백질-단백질 상호작용을 실시간으로 관찰하는 강력한 도구
- 나노미터 수준의 분자 간 거리 변화 감지
- 살아있는 세포에서 동적 분자 상호작용 연구 가능
핵심 원리
- Energy transfer는 resonance에 의해 비방사적으로 발생
- 거리의 6제곱에 반비례하는 효율
- 매우 작은 거리 변화에도 민감
주요 용도
- Signaling pathways 연구
- Protein complexes 형성 추적
- 단백질 conformational changes 모니터링
참고 문헌
- Chapter 9: Visualizing Cells and Their Molecules
- Section: “Protein Dynamics Can Be Followed in Living Cells”
- Related Figure: 9-19, 15-49
- Related concepts: GFP, FRAP, Photoactivation