Hydropathy Plot
Hydropathy plot은 protein의 amino acid sequence로부터 membrane-spanning segment를 예측하는 방법이다. X-ray crystallography와 single-particle cryo-electron microscopy의 발전으로 많은 membrane protein의 3차원 구조가 결정되었으며, 이는 amino acid sequence로부터 lipid bilayer를 확장하는 polypeptide chain 부분을 예측할 수 있음을 확인해주었다.
원리
Membrane-spanning α Helix의 특성
Transmembrane segment를 식별하기 위한 기준:
- 길이: 약 20-30 amino acid를 포함하는 segment
- Hydrophobicity: 높은 정도의 hydrophobicity
- 구조: α helix로 lipid bilayer를 span하기에 충분한 길이
이러한 segment는 hydropathy plot에서 종종 식별될 수 있다.
방법론
Free Energy 계산
Hydropathy plot 생성 과정:
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Segment 설정
- 고정된 크기의 segment 선택 (보통 10-20 amino acid)
- Polypeptide chain의 각 연속적인 amino acid에서 시작하여
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Free Energy 계산
- Polypeptide chain의 연속적인 segment를 nonpolar solvent에서 물로 transfer하는데 필요한 free energy 계산
- Model compound로부터 얻은 data를 사용하여 각 segment의 amino acid 조성으로부터 계산
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Hydropathy Index
- Y축에 segment의 hydropathy index를 plot
- Chain에서의 위치의 함수로 표시
- Positive value: 물로의 transfer에 free energy 필요 (segment가 hydrophobic)
- 값은 필요한 energy 양의 index
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결과 해석
- Amino acid sequence에서 hydrophobic segment의 위치에 peak 나타남
예시
위 그림은 두 membrane protein의 hydropathy plot을 보여준다:
(A) Glycophorin
- Single membrane-spanning α helix 보유
- Hydropathy plot에서 하나의 corresponding peak
특성:
- Peak의 위치가 transmembrane segment 위치를 나타냄
- Peak의 높이가 hydrophobicity 정도를 나타냄
(B) Bacteriorhodopsin
- 7개의 membrane-spanning α helix 보유
- Hydropathy plot에서 7개의 corresponding peak
특성:
- 각 peak가 하나의 transmembrane helix에 대응
- 7개의 distinct peak가 명확히 보임
한계
β Barrel의 경우
Hydropathy plot은 membrane-spanning β barrel의 segment를 식별할 수 없다:
이유:
- β barrel을 횡단하는데 10개 이하의 amino acid로 충분
- Extended β strand로서
- 모든 다른 amino acid side chain만 hydrophobic하면 됨
- 따라서 hydropathy plot에서 명확한 peak를 형성하지 않음
Partial Membrane Insertion
Multipass transmembrane protein은:
- Membrane을 완전히 span하지 않는 region도 포함 가능
- Membrane의 양쪽에서 folding하여 들어감
- Transmembrane α helix 사이의 공간으로 squeeze됨
- Bilayer의 hydrophobic core와 접촉하지 않음
이러한 region의 특성:
- 다른 polypeptide region과만 상호작용
- Hydrogen-bonding을 maximize할 필요 없음
- 다양한 secondary structure 가질 수 있음
- Partway across bilayer만 확장하는 helix 포함 가능
위 그림은 aquaporin water channel의 두 short α helix를 보여준다. 각각이 lipid bilayer를 halfway만 span한다. 이러한 colored helix는 protein-protein interaction에 의해 형성된 interface에 묻혀 있다.
결과:
- 이러한 region은 hydropathy plot에서 식별될 수 없음
- Protein의 3차원 구조 결정으로만 밝혀짐
- 또는 구조가 알려진 homologous protein과의 sequence alignment로
추정과 중요성
Hydropathy plot으로부터:
- 유기체 protein의 약 30%가 transmembrane protein으로 추정됨
- 이는 membrane protein의 중요성을 강조함
현대적 접근
현대에는 hydropathy plot과 함께:
- X-ray crystallography
- Single-particle cryo-electron microscopy
- Sequence alignment with known structures
- Computational prediction algorithms
이러한 방법들이 결합되어 membrane protein 구조를 더 정확히 예측한다.