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Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

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개요

강한 background fluorescence(배경 형광)는 out-of-focus 분자들이 방출하거나 산란시킨 빛 때문에 발생하며, 이는 관심 있는 특정 분자의 형광을 가려버리는 경향이 있다. 이 문제는 total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy라는 특수한 광학 기술을 사용하여 해결할 수 있다.

TIRF의 원리

Total Internal Reflection

기본 메커니즘: TIRF microscope에서 laser light는 total internal reflection이 발생하는 정확한 임계각으로 cover-slip 표면에 비춘다.

Total internal reflection 때문에:

  • 빛이 sample로 들어가지 않음
  • 대부분의 형광 분자들은 조명되지 않음

Evanescent Field

전자기 에너지 확장:

  • Total internal reflection에도 불구하고 전자기 에너지는 evanescent field로 확장됨
  • Cover slip 표면 너머 매우 짧은 거리까지만 표본으로 연장
  • Cover slip에 부착되었거나 표면에 매우 가까운 분자들만 여기됨

결과: 이 분자들이 형광을 발할 때, 방출된 빛은 더 이상 overlying molecules의 out-of-focus light와 경쟁하지 않으므로 검출 가능

Figure 9-38: TIRF Microscopy

(A) TIRF의 광학적 원리

Excitatory laser light:

  • Cover-slip 표면을 critical angle로 조명
  • Glass-water interface에서 모든 빛이 반사됨 Evanescent wave:
  • 일부 전자기 에너지가 interface를 가로질러 짧은 거리로 확장
  • Cover slip에 부착되었거나 표면에 매우 가까운 분자들만 여기
  • 약 200 nm 깊이까지만 효과적

(B) Clathrin-coated Pit 형성 추적

실험 시스템:

  • Arabidopsis root cell의 plasma membrane 표면 이미지
  • Clathrin adaptor protein이 GFP로 tagged 관찰:
  • 개별 clathrin-coated pits를 시간에 따라 추적 가능
  • Pit의 형성과 subsequent endocytosis 관찰

(C) 개별 Pit의 시간 경과

B에서 링으로 표시된 pit의 1초 간격 이미지:

  • Pit의 출현
  • Plasma membrane에서의 endocytosis에 의한 제거
  • 전체 과정이 약 10초 소요

TIRF의 특징

제한된 깊이

현재 기술:

  • 세포 표면 아래 약 200 nm 층으로 제한
  • 매우 얇은 영역만 관찰 가능 이유:
  • Evanescent wave의 침투 깊이가 매우 짧음
  • Exponentially decay함

응용 가능 영역

세포 표면 근처 구조:

  • Plasma membrane proteins
  • Membrane-associated processes
  • Cell adhesion molecules
  • Receptor dynamics

TIRF의 주요 응용

1. Single Motor Proteins

극적인 실험 예시:

  • 단일 motor proteins의 imaging
  • Microtubules를 따라 이동하는 motor proteins
  • Actin filaments를 따라 이동하는 motor proteins 장점:
  • 개별 분자 수준의 관찰
  • 이동 속도와 방향 정밀 측정
  • Step size 측정 가능

2. Membrane Dynamics

Receptor trafficking:

  • 세포막에서의 receptor 이동
  • Clustering 형성
  • Lateral diffusion Endocytosis/Exocytosis:
  • Clathrin-coated pit 형성 (Figure 9-38B, C)
  • Vesicle fusion
  • Membrane recycling

3. Cell-Substrate Interactions

Focal adhesions:

  • Adhesion complex 형성
  • Cell migration 중 adhesion dynamics
  • Force transmission

4. Single-Molecule Studies

DNA-protein interactions:

  • DNA replication
  • Transcription
  • DNA repair Enzyme kinetics:
  • 단일 효소 분자의 활성
  • Substrate binding/release
  • Catalytic cycles

변형 기술: Highly Inclined Laminated Optical Sheet

HILO Microscopy

원리:

  • TIRF는 아니지만 유사한 접근
  • 입사광의 각도를 줄임
  • Cover slip에 거의 평행하게 조명 장점:
  • 세포 내부 더 깊이 검사 가능
  • 200 nm 이상의 깊이
  • 균일하지는 않지만 더 넓은 영역 관찰 유용성:
  • 식물 세포와 같이 outer wall이 있는 세포
  • 곰팡이 세포
  • 두꺼운 표본

TIRF의 장점

1. 극도로 낮은 Background

최소화된 배경 형광:

  • Out-of-focus light 거의 완전 제거
  • 매우 높은 signal-to-noise ratio
  • Single-molecule detection 가능

2. 높은 시간 해상도

빠른 Imaging:

  • 낮은 background로 인해 짧은 exposure time
  • 빠른 동적 과정 추적
  • Video rate imaging 가능

3. 광표백 최소화

제한된 조명:

  • 표면 근처 분자들만 조명
  • 세포 내부 형광 단백질 보존
  • 장시간 관찰 가능

4. 광독성 감소

세포 손상 최소화:

  • 제한된 영역만 조명
  • 세포 전체에 대한 빛 노출 감소
  • 살아있는 세포 장기 관찰

제한사항

1. 깊이 제한

얕은 침투:

  • 약 200 nm로 제한
  • 세포 내부 깊은 곳 관찰 불가
  • 표면 현상에만 국한

2. 특수 장비 필요

기술적 요구사항:

  • 정밀한 각도 제어
  • 고품질 optics
  • 특수 objective lens
  • Laser illumination system

3. 샘플 준비

Cover slip 의존성:

  • 세포가 cover slip에 부착되어야 함
  • Floating cells는 관찰 어려움
  • 조직 절편은 적용 불가

TIRF vs 다른 현미경 기술

vs Confocal Microscope

Confocal:

  • 3D imaging 가능
  • 더 깊은 침투 (수십 μm)
  • Out-of-focus light를 pinhole로 제거 TIRF:
  • 표면만 (200 nm)
  • 더 낮은 background
  • Single-molecule sensitivity

vs Wide-field Fluorescence

Wide-field:

  • 전체 시편 조명
  • 높은 background
  • 깊이 전체 관찰 TIRF:
  • 표면만 조명
  • 극도로 낮은 background
  • 표면 현상에 특화

vs FRAP

공통점:

  • 살아있는 세포 dynamics 연구
  • 형광 단백질 사용 차이점:
  • TIRF: 공간 선택성 (표면)
  • FRAP: 시간 선택성 (photobleaching)

실험적 고려사항

임계각 최적화

각도 조절:

  • Total internal reflection을 위한 정확한 각도
  • 너무 얕으면: 빛이 투과
  • 너무 가파르면: 조명 영역 감소

Objective Lens

고 numerical aperture 필요:

  • 일반적으로 NA > 1.4
  • Oil-immersion objective
  • TIRF-specific objectives

Illumination System

Laser 요구사항:

  • 안정적인 laser source
  • 적절한 파장
  • 균일한 조명

기술적 발전

Improved Illumination

다양한 조명 방식:

  • Through-the-objective TIRF
  • Prism-based TIRF
  • Variable angle TIRF

Multi-color TIRF

동시 다중 색상:

  • 여러 형광 단백질 동시 관찰
  • Protein-protein interactions
  • Complex dynamics

Super-resolution TIRF

TIRF와 superresolution 결합:

  • PALM/STORM과 조합
  • 표면에서 nanometer resolution
  • Single-molecule localization

생물학적 응용 예시

Membrane Protein Trafficking

Receptor dynamics:

  • EGFR internalization
  • GPCR signaling
  • Ion channel gating

Cytoskeletal Dynamics

Actin polymerization:

  • 세포 가장자리에서의 actin dynamics
  • Lamellipodium formation
  • Cell migration

Vesicle Fusion

Exocytosis:

  • Synaptic vesicle fusion
  • Hormone secretion
  • Neurotransmitter release

Cell Adhesion

Focal adhesion dynamics:

  • Integrin clustering
  • Adhesion assembly/disassembly
  • Force generation

데이터 분석

Single-Molecule Tracking

분석 방법:

  • Particle tracking algorithms
  • Trajectory analysis
  • Diffusion coefficient 계산

Quantification

측정 가능한 parameters:

  • Molecule count
  • Dwell time
  • Binding kinetics
  • Diffusion rates

요약

핵심 원리: Total internal reflection으로 evanescent wave 생성, cover slip 표면 근처(~200 nm)만 조명, 극도로 낮은 background

주요 특징: Single-molecule sensitivity, 높은 시간 해상도, 최소 광표백, 표면 현상에 특화

주요 응용: Motor proteins imaging, Membrane dynamics, Endocytosis/exocytosis, Cell-substrate interactions, Single-molecule studies

제한사항: 깊이 제한(200 nm), 특수 장비 필요, Cover slip 의존성

생물학적 의의: Membrane trafficking, Cytoskeletal dynamics, Vesicle fusion, Cell adhesion, Molecular motors

참고 문헌

Graph View

Backlinks