Quartz 4

000_Fluorescence Microscopy(형광현미경)

8 min read

Filters와 mirror

  1. Exitation filter
    • 450~490nm 필터 통과
  2. beam-splitting mirror
    • 510nm 보다 짧은 파장(파란 빛) 반사
    • 510nm 보다 긴 파장(형광 emmision) 통과
  3. second barrier filter
    • 520~560nm(형광 emmision) 필터 통과

Figure 9-10 형광과 형광현미경(Fluorescence and the Fluorescence Microscope)

(A) 형광색소(fluorochrome) 분자의 궤도 전자(orbital electron)는 광자(photon)의 흡수 후 여기 상태(excited state)로 올라갈 수 있다. 형광(fluorescence)은 전자가 바닥 상태(ground state)로 돌아가면서 더 긴 파장의 광자를 방출할 때 발생한다. 빛에 너무 많이 노출되거나 너무 밝은 빛은 광표백(photobleaching)이라는 과정에서 형광색소 분자를 파괴할 수 있다. (B) 일반적인 형광 염료인 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC)의 여기 및 방출 스펙트럼(excitation and emission spectra). (C) 형광현미경에서 필터 세트(filter set)는 두 개의 차단 필터(barrier filters) (1과 3)와 하나의 이색성(dichroic) (빔 분할, beam-splitting) 거울(mirror) (2)로 구성된다. 이 예시는 형광 분자 플루오레세인 검출을 위한 필터 세트를 보여준다. 고개구수(high-numerical-aperture) 대물렌즈(objective lenses)는 이 유형의 현미경에서 특히 중요한데, 주어진 배율(magnification)에 대해 형광 이미지의 밝기(brightness)가 개구수(numerical aperture)의 4제곱에 비례하기 때문이다 (그림 9-5 참조).

DAPI GFP FITC YFP Cys

GFP, FITC, YFP는 같이 사용할 수 없음. 육안으로 볼 때 방출광이 구별되지 않기 때문 보통 DAPI, GFP, 붉은색 방출(CYS 혹은 rhodaminB)

  • 이떄 노란색은 안씀. 녹색 + 붉은색인지 고유한 단백질인지 판별할 수 없어서.

형광현미경은 세포와 조직(tissues)에서 특정 단백질(proteins)이나 다른 분자들을 검출하는 데 가장 자주 사용된다. 예를 들어, 형광 뉴클레오타이드 프로브(fluorescent nucleotide probes)를 사용할 때, 앞서 논의된 제자리 혼성화(in situ hybridization)(그림 8-63 참조)는 절편 재료(sectioned material)나 작은 생물체, 기관 또는 세포의 전체 표본(whole mounts)에서 특정 발현된 RNA 분자의 세포 내 분포와 풍부도를 밝혀낼 수 있다 (그림 9-11).

Fluorescent dyes(형광염료)

다재다능하고 널리 사용되는 기술은 형광 염료를 항체 분자(antibody molecules)에 결합시키는 것인데, 그러면 이들은 세포나 세포외 기질(extracellular matrix)에서 인식하는 특정 거대분자(macromolecules)에 선택적으로 결합하는 매우 특이적이고 다용도의 염색 시약(staining reagents) 역할을 한다. 이 목적으로 일반적으로 사용되어 온 두 가지 형광 염료는

  • 플루오레세인(fluorescein)(청색광으로 여기될 때 강렬한 녹색 형광을 방출함)과
  • 로다민(rhodamine)(녹황색 빛으로 여기될 때 짙은 적색 형광을 방출함)이다 (그림 9-12).

하나의 항체를 플루오레세인에, 다른 항체를 로다민에 결합시킴으로써, 같은 세포에서 다른 분자들의 분포를 비교할 수 있다; 두 분자는 각 염료에 특이적인 두 세트의 필터 사이를 전환하면서 현미경에서 별도로 관찰된다. 그림 9-13에서 보여주듯이, 여러 형광 염료를 같은 방식으로 사용하여 같은 세포에서 여러 다른 유형의 분자들을 명확하게 구별할 수 있다.

Cy3, Cy5, 알렉사 염료(Alexa dyes)와 같은 많은 형광 염료들은 형광현미경을 위해 특별히 개발되었지만, 많은 유기 형광색소(organic fluorochromes)들과 마찬가지로 지속적으로 조명될 때 상당히 빠르게 퇴색(fade)된다. 이 장의 후반부에서는 살아있는 세포(living cells) 내부의 특정 분자의 농도(concentration)와 위치 변화를 모니터링하는 데 사용될 수 있는 추가적인 형광현미경 방법들이 논의될 것이다.

모든 현미경 방법과 마찬가지로 고려해야 할 장단점(trade-offs)이 있다. 모든 형광현미경에서 이미지화할 수 있는 분자는 형광 표지(fluorescently labeled)된 것들뿐이다12; 세포의 다른 모든 분자들은 보이지 않은 채로 남아있다.

2. 요약

형광현미경의 원리

  • 형광 분자는 특정 파장의 빛을 흡수하고 더 긴 파장의 빛을 방출하는 특성을 가짐
  • 두 세트의 필터 사용: ① 여기 파장만 통과시키는 필터, ② 방출된 형광만 통과시키는 필터
  • 어두운 배경에서 극소량의 형광 분자도 선명하게 검출 가능

주요 응용 분야

  • 제자리 혼성화(in situ hybridization): 형광 뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 세포 내 특정 RNA의 분포와 풍부도 확인
  • 항체 기반 형광 염색: 형광 염료를 항체에 결합시켜 특정 단백질이나 거대분자를 선택적으로 검출
  • 다중 형광 염색: 플루오레세인(녹색), 로다민(적색) 등 여러 형광 염료를 동시 사용하여 한 세포에서 여러 분자를 동시에 구별하여 관찰

주요 형광 염료

  • 플루오레세인(fluorescein): 청색광 여기 → 녹색 형광 방출
  • 로다민(rhodamine): 녹황색광 여기 → 적색 형광 방출
  • Cy3, Cy5, 알렉사 염료: 형광현미경 전용으로 개발된 염료들

한계점

  • 형광 염료가 지속적인 조명에 빠르게 퇴색됨
  • 형광 표지된 분자만 관찰 가능하고, 표지되지 않은 세포 내 다른 분자들은 보이지 않음

Fluorescence Microscopy

Footnotes

  1. 2021 중간 4번 — 형광현미경에서 형광 표지된 분자만 관찰 가능하고 나머지는 보이지 않는다는 원리, 두 필터 세트 사용 등 형광현미경의 기본 특성이 출제됨. ↩

  2. 2021 중간 미상A번 — 형광현미경(fluorescence microscopy)의 정의가 여러 현미경 정의 문항에서 출제됨. 복기 불완전. (선지 미복기) ↩

Graph View

Backlinks