개선된 방법: Multiphoton Microscopy
특수 현미경들은 fluorescent molecules가 여기되는 방식을 활용하여 표본 내 더 깊이 탐사할 수 있다.1
Two-photon Effect(2광자 효과)
기본 원리:
- Fluorescent molecules는 일반적으로 방출되는 빛보다 짧은 파장의 single high-energy photon에 의해 여기됨
- 긴 파장의 두 개(또는 그 이상)의 lower energy photons의 흡수로도 여기 가능
- 단, 두 photons가 femtosecond 이내에 도착해야 함
장점:
- Background noise 감소: 광자 밀도가 높은 초점지역에서만 의미있는 흡수가 일어나기 때문에 그 외의 지역은 형광이 발생하지 않음
- 더 깊은 침투: Red 또는 near-infrared light는 산란이 덜하고 투과가 좋아 표본 내 더 깊이 침투 가능2
- 세포 손상 감소: Infrared laser light는 visible light보다 살아있는 세포에 덜 손상을 줌3
성능:
- Multiphoton microscopes는 때때로 표본 내 0.5 millimeter 깊이에서도 선명한 이미지 획득 가능
- 살아있는 조직 연구에 특히 가치 있음
- 특히 살아있는 뇌 표면 바로 아래 synapses와 neurons의 dynamic activity imaging에 유용
Figure 9-26: Multiphoton Imaging 예시
살아있는 마우스 뇌 피질 내부 거의 0.5 mm까지 볼 수 있다:
- Calcium 농도에 따라 형광이 변하는 dye 사용
- Dendritic spines(빨간색)의 active synapses(노란색)를 보여줌
- 시간의 함수로 변화를 추적 (이 경우 각 이미지 사이에 하루 간격)
- Infrared laser light 사용으로 가능
Footnotes
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2021 중간 미상A번 — 두 광자 현미경(two-photon/multiphoton)의 정의(NIR 사용, 더 깊은 조직 침투)가 여러 현미경 정의 문항에서 출제됨. 복기 불완전. (선지 미복기) ↩
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2023 중간 13번 — ④번 선지(정답): Confocal 현미경에서 고에너지 단광자 빛이 250 μm 깊은 조직에서 산란·흡수되어 형광 들뜸 자체가 불가능하다. 이를 해결하려면 NIR/적외선을 이용하는 multiphoton microscopy가 필요하다. ①번 오답 근거: 더 긴 파장(낮은 에너지)은 형광 들뜸에 불리하다. ↩
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2021 중간 5번 — 두 광자 현미경의 특성: NIR/적외선 사용, 가시광보다 더 깊은 조직 침투(~0.5 mm), 가시광 대비 낮은 phototoxicity가 정답 근거로 활용됨. ↩