Confocal Microscope
개요
Confocal microscope(공초점 현미경)는 deconvolution과 유사한 결과를 얻지만, 측정 전에 빛을 조작하는 방식으로 작동한다. 이는 디지털 기술이 아닌 아날로그 기술이다. Confocal microscope의 광학적 세부사항은 복잡하지만, 기본 개념은 단순하며(Figure 9-24 참조), 그 결과는 기존 광학 현미경보다 훨씬 우수하다. 150μm 깊이까지만 이미지를 얻을 수 있음.
작동 원리
기본 구성
Confocal microscope는 일반적으로 fluorescence optics(형광 광학계)와 함께 사용된다(Figure 9-10C 참조). 그러나 일반적인 방식처럼 전체 표본을 한 번에 조명하는 대신, 광학 시스템은 순간적으로 표본 내 특정 깊이의 단일 지점에 빛의 점을 집속한다.
Pinpoint Illumination(점 조명)
- 광원: 일반적으로 pinhole(핀홀)을 통과한 laser 빛으로 제공
- 형광 수집: 조명된 물질에서 방출된 형광이 적절한 light detector에 수집되어 이미지 생성
- Confocal aperture: Detector 앞에 pinhole aperture가 배치되며, 이는 조명 pinhole과 confocal(공초점) 위치에 있음1
- 즉, 표본 내 조명된 지점에서 방출된 광선이 초점을 맞추는 정확한 위치에 있음
- 따라서 표본의 이 지점에서 나온 빛은 이 aperture에 수렴하여 detector로 들어감
Out-of-focus Light의 제거
- 표본의 초점이 맞지 않는 영역에서 방출된 빛은 pinhole aperture에서도 초점이 맞지 않음
- 따라서 이러한 빛은 detector에서 대부분 제외됨
- 이를 통해 out-of-focus blur(초점이 맞지 않는 흐릿함)가 제거되어 선명한 optical section(광학 절편)을 얻을 수 있음
Scanning(주사) 과정
- Two-dimensional image를 구축하기 위해 초점 평면의 각 지점에서 데이터가 순차적으로 수집됨
- 한쪽에서 다른 쪽으로 일정한 pixel 패턴으로 field를 가로질러 scanning
- 데이터는 computer screen에 표시됨
Three-dimensional Imaging(3차원 영상화)
서로 다른 깊이에서 촬영한 일련의 optical sections을 computer에 저장하면 three-dimensional image를 재구성할 수 있다(Movie 9.1 참조).
Deconvolution Methods와의 비교
Confocal Microscopy의 장점
- 두꺼운 표본에 더 적합: High levels of out-of-focus light가 있는 두꺼운 표본(150 μm)에 일반적으로 더 우수
- 사용 용이성: Deconvolution systems보다 일반적으로 사용이 더 쉬움
- 빠른 결과: 최종 optical sections을 빠르게 볼 수 있음
Deconvolution의 장점
(강의노트상 표기. 실제론 ‘image deconvolution’;computational approach)
- Photon 수집 효율: Deconvolution systems에 사용되는 CMOS cameras는 방출되는 거의 모든 photon을 수집하는 데 매우 효율적
- 약한 표본에 적합: 너무 약하게 염색되었거나 confocal microscopy에 사용되는 밝은 빛으로 쉽게 손상되는 표본에서 상세한 three-dimensional images를 만드는 데 사용 가능2
제한사항
두께 제한
두 방법 모두 매우 두꺼운 표본을 다루는 데 한계가 있다:
- Deconvolution methods: 표본 깊이 약 40 μm 이상에서는 빠르게 효과가 떨어짐
- Confocal microscopes: 최대 약 150 μm 깊이까지만 이미지를 얻을 수 있음2
그럼에도 noise 발생
- 빛이 모이는 곳에서 가장 밝은 형광이 나오지만 빛의 경로에 있는 시료에도 형광이 발생함. 이것이 핀홀의 가장자리로 소량 들어옴
- out of focus 빛 중에PSF의 꼬리부분에 해당하는 빛이 핀홀로 들어옴
- out of focus 빛이 시료 내에서 산란, 굴절하며 핀홀로 들어옴
➡Multiphoton Microscopy가 대안Multiphoton Microscopy
개선된 방법: Multiphoton Microscopy
특수 현미경들은 fluorescent molecules가 여기되는 방식을 활용하여 표본 내 더 깊이 탐사할 수 있다.1
Two-photon Effect(2광자 효과)
기본 원리:
- Fluorescent molecules는 일반적으로 방출되는 빛보다 짧은 파장의 single high-energy photon에 의해 여기됨
- 긴 파장의 두 개(또는 그 이상)의 lower energy photons의 흡수로도 여기 가능
- 단, 두 photons가 femtosecond 이내에 도착해야 함
장점:
- Background noise 감소: 광자 밀도가 높은 초점지역에서만 의미있는 흡수가 일어나기 때문에 그 외의 지역은 형광이 발생하지 않음
- 더 깊은 침투: Red 또는 near-infrared light는 산란이 덜하고 투과가 좋아 표본 내 더 깊이 침투 가능2
- 세포 손상 감소: Infrared laser light는 visible light보다 살아있는 세포에 덜 손상을 줌3
성능:
- Multiphoton microscopes는 때때로 표본 내 0.5 millimeter 깊이에서도 선명한 이미지 획득 가능
- 살아있는 조직 연구에 특히 가치 있음
- 특히 살아있는 뇌 표면 바로 아래 synapses와 neurons의 dynamic activity imaging에 유용
Figure 9-26: Multiphoton Imaging 예시
살아있는 마우스 뇌 피질 내부 거의 0.5 mm까지 볼 수 있다:
- Calcium 농도에 따라 형광이 변하는 dye 사용
- Dendritic spines(빨간색)의 active synapses(노란색)를 보여줌
- 시간의 함수로 변화를 추적 (이 경우 각 이미지 사이에 하루 간격)
- Infrared laser light 사용으로 가능
Footnotes
-
2021 중간 미상A번 — 두 광자 현미경(two-photon/multiphoton)의 정의(NIR 사용, 더 깊은 조직 침투)가 여러 현미경 정의 문항에서 출제됨. 복기 불완전. (선지 미복기) ↩
-
2023 중간 13번 — ④번 선지(정답): Confocal 현미경에서 고에너지 단광자 빛이 250 μm 깊은 조직에서 산란·흡수되어 형광 들뜸 자체가 불가능하다. 이를 해결하려면 NIR/적외선을 이용하는 multiphoton microscopy가 필요하다. ①번 오답 근거: 더 긴 파장(낮은 에너지)은 형광 들뜸에 불리하다. ↩
-
2021 중간 5번 — 두 광자 현미경의 특성: NIR/적외선 사용, 가시광보다 더 깊은 조직 침투(~0.5 mm), 가시광 대비 낮은 phototoxicity가 정답 근거로 활용됨. ↩
Multiphoton Microscopy
개선된 방법: Multiphoton Microscopy
특수 현미경들은 fluorescent molecules가 여기되는 방식을 활용하여 표본 내 더 깊이 탐사할 수 있다.1
Two-photon Effect(2광자 효과)
기본 원리:
- Fluorescent molecules는 일반적으로 방출되는 빛보다 짧은 파장의 single high-energy photon에 의해 여기됨
- 긴 파장의 두 개(또는 그 이상)의 lower energy photons의 흡수로도 여기 가능
- 단, 두 photons가 femtosecond 이내에 도착해야 함
장점:
- Background noise 감소: 광자 밀도가 높은 초점지역에서만 의미있는 흡수가 일어나기 때문에 그 외의 지역은 형광이 발생하지 않음
- 더 깊은 침투: Red 또는 near-infrared light는 산란이 덜하고 투과가 좋아 표본 내 더 깊이 침투 가능2
- 세포 손상 감소: Infrared laser light는 visible light보다 살아있는 세포에 덜 손상을 줌3
성능:
- Multiphoton microscopes는 때때로 표본 내 0.5 millimeter 깊이에서도 선명한 이미지 획득 가능
- 살아있는 조직 연구에 특히 가치 있음
- 특히 살아있는 뇌 표면 바로 아래 synapses와 neurons의 dynamic activity imaging에 유용
Figure 9-26: Multiphoton Imaging 예시
살아있는 마우스 뇌 피질 내부 거의 0.5 mm까지 볼 수 있다:
- Calcium 농도에 따라 형광이 변하는 dye 사용
- Dendritic spines(빨간색)의 active synapses(노란색)를 보여줌
- 시간의 함수로 변화를 추적 (이 경우 각 이미지 사이에 하루 간격)
- Infrared laser light 사용으로 가능
Footnotes
-
2021 중간 미상A번 — 두 광자 현미경(two-photon/multiphoton)의 정의(NIR 사용, 더 깊은 조직 침투)가 여러 현미경 정의 문항에서 출제됨. 복기 불완전. (선지 미복기) ↩
-
2023 중간 13번 — ④번 선지(정답): Confocal 현미경에서 고에너지 단광자 빛이 250 μm 깊은 조직에서 산란·흡수되어 형광 들뜸 자체가 불가능하다. 이를 해결하려면 NIR/적외선을 이용하는 multiphoton microscopy가 필요하다. ①번 오답 근거: 더 긴 파장(낮은 에너지)은 형광 들뜸에 불리하다. ↩
-
2021 중간 5번 — 두 광자 현미경의 특성: NIR/적외선 사용, 가시광보다 더 깊은 조직 침투(~0.5 mm), 가시광 대비 낮은 phototoxicity가 정답 근거로 활용됨. ↩
Figure 설명
Figure 9-24: Confocal Fluorescence Microscope
(A) 기본 구성도
- Standard fluorescence microscope(Figure 9-10C 참조)와 유사한 광학 구성요소의 기본 배열
- 차이점: Laser를 사용하여 small pinhole을 조명하며, 그 이미지가 three-dimensional (3D) 표본의 단일 지점에 집속됨
(B) 형광 방출
- 표본의 이 focal point에서 방출된 형광이 두 번째 (confocal) pinhole에 집속됨
(C) Out-of-focus light 제거
- 표본의 다른 곳에서 방출된 빛은 pinhole에서 초점이 맞지 않음
- 따라서 최종 이미지에 기여하지 않음
- 표본을 가로질러 light beam을 scanning함으로써
- 정확한 초점 평면의 매우 선명한 two-dimensional image가 구축됨
- 표본의 다른 영역에서 나온 빛으로 인해 크게 저하되지 않음
(D) 상업용 버전
- Laser scanning confocal microscopes의 상업용 버전은 upright 및 inverted microscopes 모두에 구성 가능
- 표준 upright confocal microscope를 보여줌
참고 문헌
- Chapter 9: Visualizing Cells and Their Molecules
- Section: “The Confocal Microscope Produces Optical Sections by Excluding Out-of-Focus Light”
- Related Figures: 9-24, 9-25, 9-26
- Related Movie: Movie 9.1
Footnotes
-
2022 중간 5번 — 공초점 현미경의 핀홀(pinhole)을 통한 out-of-focus light 제거 및 optical section 형성 원리가 출제됨. 복기 불완전. (선지 미복기) ↩
-
2023 중간 13번 — ④번 선지(정답): Confocal에서 사용하는 고에너지 단광자 빛(가시광선)은 조직에서 산란·흡수되어 250 μm 깊은 곳까지 침투 불가, 형광 들뜸 자체가 안 됨. Confocal microscope 최대 깊이 약 150 μm. ②번 오답: 더 강한 빛 사용은 광독성(phototoxicity) 및 광표백(photobleaching) 악화. ③번 오답: Deconvolution은 이미 얻어진 이미지의 blur를 수학적 처리로 제거하는 방법이며, 빛 자체가 깊이 도달하지 못하는 문제를 해결하지 못함. ↩ ↩2