Quartz 4

Immunofluorescence Staining

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Antibodies for Protein Detection

Applications in Microscopy

Fluorescence Microscopy

  • Fluorescent dyes(형광 염료)와 결합: Antibodies를 fluorescent dyes에 화학적으로 연결하여 사용
  • 세포 내 특정 molecules(분자) 위치 확인: Fluorescence microscopy(형광 현미경)를 통해 cells(세포) 내 특정 molecules의 위치를 파악
  • 일반적 사용 형광 염료:

Multiple Labeling

  • 하나의 antibody를 fluorescein에, 다른 antibody를 rhodamine에 결합하여 같은 cell(세포)에서 서로 다른 molecules(분자)의 distribution(분포)를 비교 가능
  • 두 molecules는 각 dye(염료)에 특화된 filter sets(필터 세트)를 전환하여 따로 visualize(시각화) 가능
  • Multiple fluorescent dyes를 사용하여 같은 cell에서 여러 유형의 molecules를 명확하게 구별 가능 (Figure 9–13 참조)

Detection Methods

Direct vs Indirect Immunocytochemistry

Primary Antibody(1차 항체):

  • 관심 있는 protein(단백질)에 직접 결합
  • Marker molecule(표지 분자)에 직접 연결 가능
  • nonspecific한 형광을 줄일 수 있음.

Secondary Antibody(2차 항체):

  • Primary antibody에 결합하는 antibody1
  • Labeled secondary antibodies의 group이 사용될 때 더 강한 signal(신호) 생성
  • 이 과정을 indirect immunocytochemistry(간접 면역세포화학)라고 함23

장단점:

  • Indirect method가 더 sensitive(민감)하지만 덜 specific함.
  • 그래서 indirect method에는 nonspecific한 형광이 나와 노이즈가 생김.
  • 여러 secondary antibody molecules가 각 primary antibody를 인식하기 때문

Signal Amplification

Antibodies를 probes로 사용할 때 fluorescent signal(형광 신호) 증폭 방법:

  • Marker molecule(fluorescent dye 등)을 primary antibody에 직접 연결 가능하기도 하지만
  • Unlabeled primary antibody 사용 후 labeled secondary antibodies로 검출하면 더 강한 signal 획득 가능

immunocytochemistry의 단점

살아있는 세포에 antibody를 집어넣는 침습적 과정에서 세포가 죽음. 따라서 살아있는 세포 관찰 불가능 대안이 GFP fusion단백질

References

Footnotes

  1. 2022 중간 3번 — 동일 숙주 종(예: 모두 rabbit) 유래의 2개 1차 항체를 사용하면, 2차 항체가 이들을 구별할 수 없어 두 target 단백질을 서로 다른 색으로 표지할 수 없다는 내용이 정답 근거로 활용됨. ↩

  2. 2021 중간 3번 — 항체를 이용해 조직·세포 내 특정 단백질을 형광 염료로 검출하는 immunocytochemistry 및 2차 항체를 추가 사용해 신호를 증폭하는 indirect 방법에 관한 내용이 출제됨. ↩

  3. 2021 중간 미상A번 — 면역세포화학(immunohistochemistry/immunocytochemistry)의 정의가 여러 현미경 정의 문항에서 출제됨. 복기 불완전. (선지 미복기) ↩

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Backlinks