Quartz 4

000_Ch9_Visualizing Cells_정리본

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Chapter 9: Visualizing Cells and Their Molecules — 수업 정리본

수업 범위: 광학현미경 · 형광현미경 · 전자현미경 · 초고해상도 현미경

현미경 기법별 분해능 · 깊이 한계 비교

기법분류분해능 (XY)관찰 가능 깊이살아있는 세포주요 제약·특이사항
명시야 (Bright-field)광학~200 nm제한 없음 (깊어질수록 blur ↑)가능염색 필요; 투명 시료 대비 낮음
암시야 (Dark-field)광학~200 nm제한 없음가능산란광만 검출
위상차 (Phase-contrast)광학~200 nm제한 없음가능 (No staining)투명 생세포 관찰 최적; GFP 관찰 불가
형광 (Fluorescence)광학~200 nm제한 없음 (out-of-focus noise)가능특정 분자 표지 가능; blur 심함
Deconvolution광학 + 디지털~200 nm~40 μm (효과적)가능회절한계 극복 불가; 컴퓨터 PSF 역계산
Confocal광학~200 nm~150 μm가능pinhole로 out-of-focus 제거; 아날로그
Multiphoton광학~200 nm~500 μm가능NIR 레이저, 광독성 낮음; 가장 깊은 광학 이미징
TIRF광학~200 nm~200 nm (evanescent field)가능세포막 표면 극히 제한; 단일 분자 관찰 가능
SIM초고해상도~100 nm수십 μm (3D 가능)어려움모든 형광 dye 사용 가능; 약 2배 향상
STED초고해상도~20 nmconfocal 수준어려움Photoswitchable probe 필수; depletion beam (도넛형)
STORM)초고해상도~20 nm~200 nm (TIRF 조합 시)어려움수만~수십만 cycles; 긴 촬영 시간
TEM전자현미경실용 ~0.05 nm / 생물 ~1 nm수십 nm (초박절편)불가이론적 0.002 nm; 진공, 중금속 염색 필요
SEM전자현미경~10 nm표면만불가3D 표면 이미지; 내부 구조 관찰 불가
Cryo EM전자현미경원자 수준(~nm)수백 nm (FIB lamella)불가비결정질 동결; 2017 노벨화학상
AFM기타수직 0.1 nm / 수평 1 nm표면만가능힘 측정; 살아있는 세포 표면 관찰 가능

깊이 한계 요약 (깊은 것 → 얕은 것)

Multiphoton 500 μm > Confocal 150 μm > Deconvolution 40 μm > 형광/위상차 (blur 있으나 제한 없음) > TIRF / SMLM 200 nm ≈ TEM 초박절편 수십 nm > SEM · AFM (표면만)

현미경과 노벨상

인물업적수상
Frits Zernike (1888–1966)위상차 현미경 발명1953 물리학상
Ernst Ruska (1906–1988)전자현미경 개발1986 물리학상
Gerd Binnig / Heinrich Rohrer주사형 터널링 현미경(STM) 개발1986 물리학상 공동 수상
GFP 발견·개발 관련 연구자GFP의 발견과 개발2008 화학상
Eric Betzig / Stefan W. Hell / William E. Moerner형광 분자를 이용한 초고해상도 광학현미경2014 화학상
Jacques Dubochet / Joachim Frank / Richard HendersonCryo-electron microscopy 개발2017 화학상

관찰 규모 개요

현미경 별 관찰 규모

Link to original

  • 광학현미경: naked eye(1 cm) ~ 200 nm(회절한계) 범위
  • 전자현미경: ~1 nm까지 관찰 가능
  • 초고해상도(Super-resolution): 200 nm 장벽 극복 가능

이 챕터의 세 가지 큰 주제

광학 현미경 / 염색 & GFP / 전자 현미경

1. 광학현미경 (Optical Microscope)

→ optical microscope

원리 요약

  • 접안렌즈(eyepiece): 대물렌즈가 만든 상을 한 번 더 확대
  • 대물렌즈(objective): 관찰 대상을 1차 확대
  • 광원 → iris diaphragm → condenser → specimen → objective → tube lens → eyepiece
  • Dark field(암시야): 굴절된 빛만 감지 / Bright field(명시야): 직진광과 약간 산란된 빛까지 감지

분해능 (Resolution)

→ limit of resolution(분해능) / diffraction limit

  • : 구분 가능한 최소 거리
  • : 빛의 파장
  • : 렌즈의 빛 모음 정도

가시광선(400–700 nm) → 분해능 한계 약 200 nm

  • 회절한계(Diffraction limit): 물리 법칙에 의한 이론적·물리적 분해능의 한계
    • 완벽한 렌즈를 써도 극복 불가능
    • 빛의 세기, 시료 두께와는 무관 (파장·개구수에만 의존)
    • 초고해상도 현미경은 다른 물리적 원리를 이용해 이를 극복

2. 광학현미경 대비 (Contrast) 형성 원리

→ contrast(대비)

일반 광학현미경으로 세포 관찰 시 → 투명 유리판에 투명 젤 같은 느낌 → 대비 형성 필수

3가지 대비 형성 방법

방식원리현미경 종류
(A) 흡수 차이염색약이 특정 파장을 흡수 (예: 적색 염색약 → 초록/파랑 흡수, 빨강 통과)명시야(Bright-field)
(B) 산란비스듬한 입사광 → 세포 성분에 의해 산란된 빛만 대물렌즈로 수집 → 어두운 배경에 밝은 이미지암시야(Dark-field)
(C) 위상 차이빛의 위상이 세포의 더 두껍거나 밀도가 높은 부분을 통과하면서 변함 → 보강/상쇄간섭 → 밝기 차이로 변환위상차(Phase-contrast)

3. 위상차 현미경 (Phase Contrast Microscopy)

→ phase contrast microscopy(위상차 현미경)

  • 무색 투명한 시료도 관찰 가능 (Live cell imaging / No staining)
  • 빛의 위상차를 명암 차이로 변환: 세포의 밀도 차이로 생긴 보이지 않는 빛의 시간차를 특수 렌즈로 눈에 보이는 밝기 차이로 증폭
  • 형광(fluorescence)을 사용하지 않으므로 GFP 관찰 불가
  • 지엽) 1935년 F.제르니커 개발, 1953년 노벨 물리학상

원리 — Negative Phase Contrast (강의에서 이것만 언급)

  1. 세포를 통과한 회절광: 굴절률 차이로 인해 λ/4 지연 발생
  2. 직진광: 위상판(Phase Plate)에 의해 λ/4 추가 지연
  3. → 두 빛의 위상이 같아져 보강간섭 → 시료 부분이 밝게 보임

Positive phase contrast: 직진광 3λ/4 지연 → 상쇄간섭 → 시료 어둡게 보임

구성요소

  • 위상차용 대물렌즈 (렌즈에 PH: Phase 표기)
  • 위상차 콘덴서(Phase Contrast Condenser)

4. 조직 고정 및 절편 (Fixation & Sectioning)

→ Sectioning

조직은 너무 두꺼워 고해상도 직접 검사 불가 → 절편(section) 필요 (임상에서 중요한 부분)

준비 과정

고정(Fixation) → 포매(Embedding) → 절단(Sectioning) → 염색(Staining)
  1. 고정(Fixation): Glutaraldehyde (단백질 교차결합) → 분해 방지, 구조 보존
    • 고정하지 않으면 모두 분해됨
  2. 포매(Embedding): 파라핀 또는 레진을 조직에 침투 → 고체 블록 형성
    • 고정 후에도 조직은 부드럽고 연약해서 포매 필요
  3. 절단: 마이크로톰(Microtome)으로 절단 → 일반적으로 0.5–10 μm 두께
  4. 염색: 절단된 절편에 염색 필수
    • DNA/RNA/산성단백질: H&E 염색 (hematoxylin & eosin)
    • 다양한 항체로 단백질 발현 비교
    • 특정 단백질 위치: 형광 probe + marker (GFP/RFP) 이용

5. 형광현미경 (Fluorescence Microscopy)

→ 000_Fluorescence Microscopy(형광현미경)

형광(Fluorescence) 원리

형광 분자(형광색소, fluorochrome):

  1. 특정 파장의 빛(광자)을 흡수 → 전자가 excited state로 상승
  2. 전자가 ground state로 돌아오면서 더 긴 파장(낮은 에너지)의 빛 방출 = 형광

형광현미경 필터 시스템 (3단계)

1. Excitation filter (1st barrier filter)

  • 특정 파장만 통과 (예: 450~490 nm 파란빛만)

2. Beam-splitting mirror (Dichroic mirror)

  • 510 nm보다 짧은 파장(파란빛) → 반사
  • 510 nm보다 긴 파장(형광 emission) → 통과

3. Second barrier filter (Emission filter)

  • 520~560 nm (형광 emission)만 통과

주요 형광 염료 조합

색염료 예시
파랑DAPI (DNA 염색)
초록GFP, FITC
빨강Rhodamine B, Cy3, RFP, Cy5

GFP, FITC, YFP는 방출광이 겹쳐 동시에 사용 불가. 보통 DAPI(파랑) + GFP(초록) + Rhodamine/Cy3(빨강) 조합 사용. 노란색은 안 씀 — 녹색 + 붉은색인지 고유한 단백질인지 판별 불가.

Antibody를 이용한 특정 분자 검출

→ Immunofluorescence Staining

Direct vs Indirect Immunocytochemistry

방법원리특이도민감도
Direct (직접)1차 항체에 형광 직접 결합높음 (specific)낮음
Indirect (간접)1차 항체 + labeled 2차 항체낮음높음 (sensitive)
  • 1차 항체(Primary antibody): 타겟 항원에 결합
  • 2차 항체(Secondary antibody): 1차 항체에 결합; secondary antibodies로 검출하면 더 강한 signal 획득
  • Indirect method가 더 sensitive(민감)하지만 덜 specific함
    • 여러 2차 항체 분자가 각 1차 항체를 인식 → signal 증폭 but nonspecific 형광 noise 발생 가능

immunocytochemistry의 단점

살아있는 세포에 antibody를 집어넣는 침습적 과정에서 세포가 죽음 → 살아있는 세포 관찰 불가능 → 대안: GFP fusion protein

6. GFP (Fluorescent Protein Tagging)

→ GFP(Fluorescent Protein Tagging)

GFP 특징

  • 자체적으로 형광을 띠는 단백질 (외부 형광 염료 불필요)
  • Barrel 구조 (11개의 β-strand) 내부에 chromophore 보호
  • 번역 직후에는 형광 없음 → 약 1시간 이내 자가촉매적 번역 후 변형으로 성숙

GFP 활용 방법

1. Reporter molecule: GFP 유전자를 관심 유전자의 promoter 하에 배치 → 유전자 발현 패턴 시각화

(A) 초파리 실험 예시: GFP 유전자를 초파리 신경세포 특이적 promoter에 연결 → 신경세포만 형광 발현

2. GFP Fusion Protein (가장 중요):

ATG-XXXXXX(target 단백질)----GFP(형광)
             ↓
        Fusion protein

  • 살아있는 생물에서 단백질의 **distribution(분포)**과 **dynamics(역학)**를 표시하는 가장 명확한 방법
  • GFP fusion protein이 untagged protein과 기능적으로 동등함을 증명해야 함 (예: mutant rescue로 확인)
  • 대부분의 경우 GFP fusion protein이 원래 단백질과 동일한 방식으로 작동

3. Organelle targeting: GFP에 peptide location signal 추가 → 특정 organelle 형광 표지

7. 3D 이미지 획득

PSF와 Image Deconvolution

→ PSF(point spread function) / deconvolution

  • PSF (Point Spread Function): 빛의 퍼짐 정도 — 점 광원이 렌즈를 통과할 때 형성되는 3D blurred image (Gaussian distribution에 근사)
  • 광학현미경 분해능 한계, 샘플 두께, 초점 부정확성 등으로 이미지 왜곡 발생
  • Image deconvolution (이미지 복원): 컴퓨터 알고리즘으로 PSF 신호 최소화, noise 제거 → 흐려진 이미지 복원
    • 추가 수업내용: 컴퓨터가 계산해서 만든 가상의 뿌연 이미지와 실제로 현미경으로 관찰된 진짜 뿌연 이미지를 비교 → 차이가 작으면 진짜 모습
    • Diffraction limit에 의해 여전히 제약 (없는 정보를 만들어내지는 못함)
    • 표본 깊이 약 40 μm까지 효과적

Computed Tomography 개념

  • 다른 각도에서 찍은 이미지를 결합 → 이미지 재구성 (CT scanner와 동일한 원리)

8. 공초점 현미경 (Confocal Microscope)

→ Confocal Microscope

일반 형광현미경: 시료 전체에 빛 조사 → out-of-focus 빛으로 blur Confocal: 매우 작은 선택 영역만 선택적으로 빛 조사

원리

  • Laser → pinhole A 통과 → 표본의 단일 focal point에 집속
  • 그 점에서 방출된 형광 → confocal pinhole B에 집속 → detector 도달
  • 초점 밖(out-of-focus) 빛은 pinhole에서 초점 안 맞음 → detector 대부분 제외
  • 다른 깊이에서 촬영한 optical section을 쌓아 3D 이미지 재구성

특징

  • 아날로그 방식 (deconvolution은 디지털 방식)
  • 최대 약 150 μm 깊이까지만 이미지 획득 가능

그럼에도 noise가 발생하는 이유 (→ Multiphoton의 필요성)

  1. 빛의 경로에 있는 시료에도 형광이 발생 → 그 빛이 pinhole 가장자리로 소량 들어옴
  2. out-of-focus 빛 중에 PSF의 꼬리부분에 해당하는 빛이 pinhole로 들어옴
  3. out-of-focus 빛이 시료 내에서 산란·굴절되며 pinhole로 들어옴

→ 이를 해결하기 위한 대안 = Multiphoton Microscopy

9. Multiphoton Microscopy

→ Multiphoton Microscopy

배경

  • 형광 분자를 들뜨게 하려면 보통 짧은 파장(고에너지) 필요
  • 짧은 파장(청색/자외선)은 산란과 흡수가 커서 깊이 침투 불리
  • **근적외선(NIR, 긴 파장)**은 산란이 덜해 더 깊이 침투 가능

원리

  • 근적외선(NIR) 레이저로 **두 광자(two-photon)**를 femtosecond 이내에 동시 흡수 → 형광 들뜸
  • 특수 장비로 초점 지역에만 two-photon이 도달하게 함
  • 광자 밀도가 높은 초점 지역에서만 의미있는 흡수가 일어남 → 그 외 지역은 형광 발생 없음 → noise 없음

장점

  • 더 깊이 침투: NIR은 산란이 덜해 표본 내 ~500 μm 깊이까지 이미지 획득 가능
  • 낮은 광독성: 적외선 레이저가 가시광보다 세포 손상 적음
  • Background noise 감소 (confocal의 noise 문제 해결)

10. 살아있는 세포의 단백질 역학 (Protein Dynamics in Living Cells)

→ 000_Protein Dynamics in vivo MOC

(1) FRET — Fluorescence Resonance Energy Transfer

→ FRET

  • 관심 있는 두 분자를 각각 다른 fluorochrome으로 표지
  • 선택 기준: donor의 emission spectrum과 acceptor의 absorption spectrum이 **overlap(겹침)**해야 함
  • 두 단백질이 약 1–5 nm 이내로 근접 시, donor의 형광 에너지가 acceptor로 **비방사적(nonradiatively)**으로 전달 (resonance)
  • 상호작용 없으면: violet 여기 → blue emission만 / 상호작용 있으면: violet 여기 → green emission 검출
  • FRET 효율은 거리의 6제곱에 반비례(1/r⁶) → 극도로 민감
  • 단백질-단백질 상호작용 실시간 모니터링에 활용 (살아있는 세포에서)

(2) Photoactivation (광활성화)

→ Photoactivation

형광 vs 광활성화

형광: 활성화 과정 없이 특정 파장의 빛을 받으면 형광 발생 광활성화: 빛에 의해 화학 구조가 변해 새로운 형광 특성을 가짐 → 단일 분자 추적 가능

  • 빛에 의해 화학 구조가 변해 새로운 형광 특성을 가짐 — 원하는 순간, 원하는 위치에 형광
  • 과정:
    1. 활성화: 강한 빛 (자외선 or 청색광)으로 photoactivatable probe 활성화
    2. 확인: 형광을 확인할 수 있는 빛으로 이동 추적

가운데 tubulin 단백질들에만 UV로 광활성화 → 2.5분간 광활성이 줄어드는 동시에 단백질의 이동을 관측 → Spindle dynamics 확인

(3) FRAP — Fluorescence Recovery After Photobleaching

→ FRAP

  • 특정 영역에 강한 레이저를 조사해 형광을 photobleaching(표백)
  • 표백된 영역으로 주변의 형광 분자들이 이동해 들어오면서 형광 회복 관찰
  • population level 측정 (단일 분자 추적이 아님)
  • 측정 가능한 정보:
    • Diffusion coefficient (확산 계수): 회복 곡선의 기울기
    • Mobile fraction (이동 가능 분획): 최종 회복 정도
    • Immobile fraction: 회복되지 않은 비율 (고정되거나 매우 느리게 이동하는 분자)

11. 세포 내 이온 농도 측정

→ Aequorin=Light Emitting Indicator

Aequorin: Ca²⁺가 있을 때만 청색광을 방출하는 발광 단백질 (형광이 아님)

  • 0.5~10 μM 범위의 Ca²⁺ 농도 변화에 반응
  • 발광은 형광보다 신호가 약해 실험적으로 형광 물질이 더 많이 사용됨

형광 Ca²⁺ indicator: Fluorescent Biosensors for Cell Signaling

  • 모든 indicator가 Ca²⁺에 결합하는 게 아니라, 결합한 것과 안 한 것이 나뉘어 농도에 의해 색 차이 형성
  • 빨간색: 신호 약함 / 노란색: 신호 강함 (Purkinje 세포 예시)

12. TIRF — Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

→ TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy)

원리

  • 레이저를 임계각 이상으로 cover-slip에 입사 → 전반사(Total Internal Reflection) 발생
  • 전반사에도 불구하고 **evanescent field(감쇠장, 소멸파)**가 표면 너머로 약 200 nm까지만 확장
  • → cover-slip에 부착되었거나 표면에 매우 가까운 분자들만 여기

특징

  • **세포 두께(10 μm)의 약 1–2%**인 ~200 nm 깊이만 관찰
  • 세포막 바로 아래 단백질 같은 막 근처 구조 관찰에 최적
  • Background 대폭 감소 → noise 없음, 단일 분자 관찰 가능
  • 광독성 감소 / 광표백 최소화: 제한된 영역만 조명

강의노트: myosin, actin filament 관찰

13. AFM — Atomic Force Microscopy (원자력 현미경)

→ AFM(Atomic Force Microscopy)

힘(force)을 이용해 **표면 구조와 물성(topology·마찰·정전 상호작용·도전률·자력)**을 image화

구성요소

  • Tip (탐침): 원자 수준으로 매우 날카로운 구조로 시료 표면 스캔
  • Cantilever (캔틸레버): tip이 붙어 있는 지렛대 → 힘을 받으면 휘어짐
  • Laser + Detector: 캔틸레버 위에 레이저 조사 후 반사된 레이저 위치 변화를 **photodiode(detector)**로 측정

응용

  • 생물학적 시료(DNA, 단백질, 세포) 관찰
  • 예: DNA 가는 선 / MUTs 밝은 점 → DNA damage가 있는 부분에만 MUTs 단백질 검출
  • 해상도: 수직 0.1 nm, 수평 1 nm

14. 초고해상도 현미경 (Super-resolution Microscopy)

일반 광학현미경의 회절한계(~200 nm)를 극복하는 기술들 — 모두 광학현미경에 속함!

(1) SIM — Structured Illumination Microscopy

→ SIM(Structured Illumination Microscopy)

전자현미경보다 나은 광학현미경이 나왔다!!!

원리:

  • 모아레 패턴(Moiré pattern): 두 개의 주기적인 패턴이 겹쳐질 때 생성되는 간섭 무늬
  • 회절한계에 의해 얻을 수 없는 샘플의 고분해능 정보가 관찰 가능한 저분해능 모아레 무늬에 반영
  • Known 레이저 패턴과 Unknown 샘플 구조가 결합 → moiré 패턴 생성

  • 조명 패턴 각도를 바꾸면서 여러 장 촬영 → 컴퓨터로 역계산 → 숨겨진 고해상도 구조 복원

특징:

  • 분해능: ~100 nm (conventional의 약 2배 향상)
  • 모든 fluorescent dye/protein 사용 가능 (versatile)
  • 완전히 회절한계를 벗어나진 못함 (약 2배 향상에 그침)

(2) STED — Stimulated Emission Depletion Microscopy

→ STED(Stimulated Emission Depletion)

원리:

  • Excitation laser: 형광 여기 spot 생성
  • Depletion laser (도넛 모양, doughnut shape): spot 주변의 형광 분자를 stimulated emission으로 ground state로 되돌림 (photobleaching 아님! photoactivation 아님!)
  • → 오직 beam 정중앙의 극소 영역에서만 형광 발생 → PSF 크기 감소
  • Confocal과 유사하게 point-by-point scanning

특징:

  • 분해능: ~20 nm (conventional의 약 10배 향상)
  • Photoswitchable fluorescent probes 필요
  • 매우 가까이 있는 분자들이 두 가지 다른 states(형광/어두운) 중 하나에 있도록 보장 → 회절 한계 극복

(3) SMLM — Single-Molecule Localization Microscopy

→ SMLM (Single-Molecule Localization Microscopy)

대표: PALM (Photo-Activated Localization Microscopy)

3단계 원리:

1. Isolation (분리): 모든 형광 분자를 한 번에 켜지 않고, 아주 적은 수의 분자만 무작위로 형광 2. Localization (위치 결정): PSF 때문에 희미하게 보여도 정 가운데 부분은 분자의 중심 → 중심점(Center) 확인 3. Reconstruction (재구성): 반복하여 얻은 수만 개의 점 데이터를 하나의 이미지화

특징:

  • 분해능: ~20 nm (conventional의 약 10배 향상)
  • Photoswitchable labels (photoactivated / photoconvertible / photoswitchable) 필요
  • 긴 acquisition time (수만~수십만 cycles)
  • TIRF microscope와 조합해서 사용

초고해상도 기술 비교표

기술분해능원리특이사항
SIM~100 nmMoiré pattern + 역계산모든 dye 가능, 빠름
STED~20 nmPSF 축소 (depletion beam)Photoswitchable probe 필요
SMLM (PALM)~20 nm단일 분자 위치 결정 후 재구성매우 긴 촬영 시간

15. 전자현미경 (Electron Microscope)

개요

종류원리특징
TEM (투과 전자현미경)전자빔을 시료를 통과시켜 이미지 생성내부 구조, 초고분해능
SEM (주사 전자현미경)전자빔이 시료 표면을 탐침하여 이미지 생성표면 3D 이미지
Cryo EMTEM의 한 종류; 시료를 초저온에서 이미지 획득생체 분자구조 분석, 2017 노벨화학상

TEM (Transmission Electron Microscope)

→ TEM(Transmission Electron Microscope)

빛 대신 전자를 사용 — 전자도 파동의 성질을 가짐

  • ==전자의 파장은 속도가 빠를수록 짧아짐 (드브로이 파장: λ = h/mv)
  • 100–300 keV 가속 시 파장 0.0037 nm (가시광선 대비 약 10만배 짧음)
  • 이론적 분해능: ~0.002 nm (파장의 약 절반)
  • 실용적 분해능: ~0.05 nm (렌즈 수차 때문)
  • 생물학적 표본 유효 분해능: ~1 nm (시료 준비 문제, contrast 한계 등)

수차 (Aberration)

렌즈를 통과한 빛이 한 점에 모이지 못해 색이나 상이 왜곡되는 현상

  • 색수차(Chromatic Aberration): 전자빔의 에너지 불균일성(파장 차이) 때문 발생
  • 구면수차(Spherical Aberration): 렌즈 중심과 주변부를 통과하는 전자의 초점 차이 → 주변부 전자의 굴절 과다

전자 산란과 대비 형성

생체 구성 원소(C, H, O, N)는 원자번호 낮음 → 전자 산란 적음 → 대비 낮음(밝게 나타남) → 중금속 염색 필요: 핵전하 ↑ → 전자 산란 ↑ → 이미지 대비 ↑

BF (Bright Field, 명시야): 직접 통과 전자 이용 → 중금속 부위가 어둡게 보임 (생체 시료에서 가장 흔히 사용) DF (Dark Field, 암시야): 산란된 전자만 이용 → 중금속 부위가 밝게 보임 (BF와 대비 반대)

생물학적 시료 준비

→ Cryo EM_Biological Specimen Preparation for Electron Microscopy

전자빔은 매우 높은 에너지 + 진공 상태 → 살아있는 세포 관찰 불가

Conventional TEM 준비

고정(Fixation) → 탈수(Dehydration) → 포매(Resin Embedding) → 초박절편(Ultramicrotomy) → 염색
  • 고정: Glutaraldehyde (단백질 고정) + Osmium tetroxide (OsO₄) (지질·세포막 보존, 전자밀도 증가)
  • 탈수: 물을 유기용매로 대체 (물은 진공에서 증발, 레진과 섞이지 않음)
  • 포매: 레진 침투 → 블록화
  • 초박절편: ultramicrotome으로 수십 nm 두께로 절단 → metal grid 위에 올려 관찰

  • 대비 염색: uranyl acetate / phosphotungstic acid / ammonium molybdate (원자번호 높은 물질)

Negative Staining (음성 염색)

→ positively stained vs negatively stained

  • 염색이 내부로 들어가지 않고 외부에만 존재
  • 외부만 전자 산란이 많아져 어둡게 보임 → 시료 윤곽이 밝게 보임
  • 주로 분리된 단백질, 바이러스 등 macromolecule 관찰에 사용

Cryo EM

  • Vitrification (급속 동결): 물을 얼음 결정이 아닌 비결정질(유리질) 형태로 유지 → 구조 왜곡 최소화
    • 이로써 전자빔에 의해 얼음이 녹지 않음
  • Cryo-sectioning: 두꺼운 세포를 **집속 이온 빔(FIB)**으로 깎아내려 판 모양(lamella)으로 만든 후 관찰 (염색 없이)

3D 재구성

Serial sectioning → 3D 재구성: 다른 깊이의 절편 이미지들 → 컴퓨터로 쌓아 3D 구조 재구성

Single Particle Reconstruction (단일 입자 재구성):

→ Single Particle Reconstruction

  • 전자빔이 생체분자를 손상시켜 한 분자에서 얻는 전자 신호가 제한적
  • 따라서 단일 이미지로는 높은 해상도의 구조를 얻기 어려움
  • 단일 입자 재구성: 동일한 분자를 낮은 전자 밀도로 매우 많이 촬영 → 정렬(alignment) + 평균화(averaging) → 평균 이미지 생성 → SNR 향상
  • 예: HIV 캡시드 내부 단백질 구조 → **216개의 6량체(hexamer, 파란색)**와 12개의 5량체(pentamer, 노란색)

SEM (Scanning Electron Microscope)

→ SEM(Scanning Electron Microscope)

시료와 전자빔 사이에서 일어나는 ‘상호작용’을 데이터화하여 시각화

  • 후방 산란전자(Backscattered electron, BSE): 1차 전자가 핵에 의해 산란되어 나온 전자
  • 이차전자(Secondary electron, SE): 시료 표면에서 방출 → 표면 확인
  • 내부 구조 관찰 불가 → 주로 표면 3D 이미지 생성
  • 해상도: ~10 nm (standard SEM)

현미경 종합 비교표

현미경분해능살아있는 세포주요 용도
명시야(Bright-field)~200 nm고정/생 모두염색된 조직
암시야(Dark-field)~200 nm가능산란광 관찰
위상차(Phase-contrast)~200 nm가능 (No staining)Live cell imaging
형광(Fluorescence)~200 nm가능특정 분자 표지
Confocal~200 nm가능3D 광학 절편 (150 μm)
Multiphoton~200 nm가능깊은 조직 (500 μm)
TIRF~200 nm가능세포막 근처 (200 nm)
SIM~100 nm어려움초고해상도
STED / SMLM~20 nm어려움초고해상도
TEM~0.05 nm==불가내부 초미세 구조
SEM~10 nm불가표면 3D 이미지
Cryo EM~nm불가단백질 3D 구조
AFM0.1 nm (수직)가능표면·물성 측정

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